简析神经管神经管畸形三个基因突变筛查以及VANGL基因三个突变位点磷酸化

论文导读：序列保守性浅析发现,这五个特有的突变位点都并非保守,只有A1408T和G1973D这两个位点在脊椎动物进化上十分保守。说明这几个突变位点可能与人类的神经管畸形有关。在163例神经管畸形样本中,我们找到了一个WNT11的特有突变位点但没有找到FUZZY的稀有突变位点。在WNT11基因中总共发现了三个突变：C.374GA、C.408CTT、C.1037GT。
摘要：神经管畸形是指在胚胎发育的早期,由于神经管的不闭合或者闭合不完全而引起的严重的出生缺陷,主要包括无脑儿、脑膨出、颅脊柱裂以及脊柱裂等。前者主要是头部神经管不闭合,体现出严重脑发育不建全、颅骨损伤等,这些患病儿多在孕期或者出生后很短时间内死亡。而大部分脊柱裂的患儿却可以存活下来,但给家庭和社会带来了严重的精神负担和经济压力。神经管畸形在世界的平均发病率为1-2%o,而在我国的平均发病率是3‰,在部分地区其发病率高达8‰,在我国的出生缺陷中排名第二神经管畸形是多因素疾病,它不仅受到遗传因素的影响,还与环境因素有关。近年来,通过对神经管畸形小鼠的探讨表明,平面细胞极化信号通路(Planar cell polarity, PCP)中的基因的敲除对神经管的闭合起到重要作用。目前发现的PCP信号通路的核心基因有：Frizzled (Fz)、Dishevelled (Dsh/Dvl)、Strabius/Van Gogh (Stam/Vang)、Flamingo (Fmi)、Prickle (Pk)和Diego (Dgo)。本论文选择了和PCP信号通路相关的三个基因(CELSR1基因、FUZZY基因和WNT11基因)做为探讨对象。采取的是病例-对照的探讨策略,在课题组现有的163例神经管畸形致死性胎儿样本中筛查病例中特有的突变,通过分子生物学、遗传学以及方式动物的探讨,来验证这些突变与神经管畸形发生的联系。另外本课题以实验室发现的人类神经管已知的Vangl基因的三个特有突变,探讨其与神经管畸形发生的联系。在163例神经管畸形的样本中,我们共检测到CELSR1的十个错义突变：A1408T、N1884S、V1897I、C1898R、G1973D、L1995R、I2107V、P2385L、R2901H、 E2903Q。而通过SNaPshot分型的策略确定了五个特有的突变：A1408T、N1884S、 V1897I、G1973D、R2901H。而通过脊椎动物氨基酸序列保守性浅析发现,这五个特有的突变位点都并非保守,只有A1408T和G1973D这两个位点在脊椎动物进化上十分保守。说明这几个突变位点可能与人类的神经管畸形有关。在163例神经管畸形样本中,我们找到了一个WNT11的特有突变位点但没有找到FUZZY的稀有突变位点。在WNT11基因中总共发现了三个突变：C.374GA、 C.408CTT、C.1037GT。其中C.408CT和C.1037GT是同义突变,C.374GA是错义突变,通过对照样本的测序,发现这个位点是神经管畸形样本特有的。在FUZZY基因中,只发现了一个同义突变：C.1199CT,且这个同义突变在13例样本中都有发现。这可能与我们神经管畸形样本量有限有关。在对VANGL基因的三个突变位点：G39S、N313S、S84F的探讨中,我们成功的构建了含这三个突变位点的表达载体。我们把这三个突变位点分别构建在pCMV6-Myc载体和带有绿色荧光标记的载体上。通过细胞生物学实验,发现这三个突变位点对它编码蛋白的磷酸化水平没有太大的影响,但却增加了蛋白的表达量。对神经管畸形发生的遗传因素探讨有着重要的临床和社会作用,希望我们的探讨为这一重要课题的进展提供有用线索。关键词：神经管畸形论文基因论文稀有突变论文相关性浅析论文功能探讨论文
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Abstract5-10
第1章 绪论10-22

1.1 神经管的形成10-13

1.1 神经管的定义10

1.2 神经管的形成10-13

1.2 神经管畸形综述13-15

1.2.1 神经管畸形的定义13

1.2.2 神经管畸形的分类13-14

1.2.3 神经管畸形的发病理由14-15

1.2.4 神经管畸形探讨进展15

1.3 PCP信号通路与神经管畸形相关性探讨15-22

1.3.1 PCP信号通路概述15-17

1.3.2 Vangl与神经管畸形的探讨进展17

1.3.3 Frizzled(Fzd)与神经管畸形的探讨近况17-18

1.3.4 Dishevelled(Dvl)与神经管畸形的联系18

1.论文导读：-44第4章VANGL基因三个突变位点对神经管畸形的影响44-604.1前言44-454.2实验材料与仪器45-474.2.1实验仪器45-464.2.2实验材料464.2.3主要溶液的配制46-474.3实验策略47-564.3.1核苷酸特异性点突变47-504.3.2把带有突变位点的载体构建到带有荧光标记的载体上50-524.3.3构建Flag-ROR2表达载体52-534.3.4细胞学实验

3.5 Prickle(Pk)与神经管畸形的探讨进展18-19

1.3.6 Digeo(Dgo)与神经管畸形的探讨进展19-22

第2章 CELSR1与神经管畸形的探讨22-36

2.1 前言22-23

2.2 探讨对象及材料23-24

2.1 探讨对象23

2.2 实验仪器和试剂23-24

2.3 探讨策略24-30

2.3.1 DNA的提取和保存24-25

2.3.2 DNA样本的保存25-26

2.3.3 CELSR1编码区的测序26-30

2.4 实验结果30-34

2.4.1 目的片段的扩增30-31

2.4.2 测序结果的统计与浅析31-33

2.4.3 氨基酸序列的保守性浅析33-34

2.4 讨论34-36

第3章 WNT11和FUZZY基因在人类神经管畸形的探讨36-44

3.1 前言36-38

3.2 探讨对象与策略38-40

3.

2.1 探讨对象38

3.

2.2 探讨策略38-40

3.3 实验结果40-42

3.1 目的基因的扩增40

3.2 测序结果的统计与浅析40-42

3.4 讨论42-44

第4章 VANGL基因三个突变位点对神经管畸形的影响44-60

4.1 前言44-45

4.2 实验材料与仪器45-47

4.

2.1 实验仪器45-46

4.

2.2 实验材料46

4.

2.3 主要溶液的配制46-47

4.3 实验策略47-56
4.

3.1 核苷酸特异性点突变47-50

4.

3.2 把带有突变位点的载体构建到带有荧光标记的载体上50-52

4.

3.3 构建Flag-ROR2表达载体52-53

4.

3.4 细胞学实验53-55

4.

3.5 Western Blotting55-56

4.4 结果56-59

4.1 构建质粒的点突变位点56-57

4.2 构建pEGFP-N_2载体的突变质粒57-58

4.3 Flag-ROR2质粒的构建58

4.4 Western Blotting检测58-59

4.5 讨论59-60

第5章 小结60-62
参考文献62-70
附录70-74
致谢74-76
攻读硕士期间探讨成果76