研究病毒丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2核酸适体对病毒生活周期影响学术

论文导读：-191.3.1SELEX技术的原理及工作流程15-161.3.2核酸适体的优点16-171.3.3核酸适体在病毒探讨中的运用17-191.4本课题探讨的案例和目的19-20第2章丙型肝炎非结构蛋白NS2的原核表达20-312.1前言202.2材料与策略20-272.2.1实验材料20-212.2.2实验策略21-272.3实验结果27-292.3.1重组质粒pET28b-NS2的获得及鉴定2
摘要：世界上大约有3%(1.7亿)的人感染了丙型肝炎病毒(HCV)，HCV可引起严重的肝脏疾病，如慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌。由于缺少针对丙肝的疫苗，且目前的治疗策略有一定的局限性，探讨新型、高效的抗HCV药物的重任迫在眉睫。NS2蛋白能够影响子代病毒颗粒装配，也能通过干扰宿主细胞的生理历程来推动病毒的复制。以NS2蛋白作为药物探讨的靶点，具有巨大的潜力。核酸适体是一类新型的识别分子,具有亲和力强、选择性高、稳定性好、易于修饰等优点，广泛用于生物检测和新药开发等方面。在HCV编码的非结构蛋白中，针对NS2蛋白的药物尚未见报道。本论文以NS2蛋白为靶标，筛选出特异结合的核酸适体，并探讨了适体对病毒生活周期的影响，取得了以下结果：（1）采取普通PCR策略成功扩增出HCV NS2基因，并将目的基因成功构建到pET28b原核表达载体中。（2）将重组质粒pET28b-NS2转到BL21感受态细胞中进行蛋白大量表达，发现此蛋白可溶性低。采取超速离心法，并加入膜表面活性剂—月桂酸，可获得可溶性强的目的蛋白，用镍柱进一步纯化得到蛋白。（3）以纯化的NS2蛋白为靶标，经过5轮筛选，得到特异结合的ssNDAaptamers。以中选择三条适体（NS2-1、NS2-2、NS2-3）浅析发现，这3种核酸适体能够特异结合到NS2蛋白上，不会与对照蛋白HCV NS5B和LacZ发生非特异性结合。（4）用荧光定量PCR和免疫荧光法检测转染核酸适体后细胞中的病毒复制和释放能力变化，发现核酸适体以一种呈剂量依赖型的方式抑制病毒复制，此外核酸适体NS2-2、NS2-3还能够抑制病毒颗粒的释放。结果表明针对NS2蛋白的核酸适体能够抑制病毒的复制和释放，有望探讨成一种新型的靶向治疗HCV的药物。关键词：丙型肝炎病毒论文非结构蛋白NS2论文核酸适体论文病毒复制论文
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Abstract6-9
第1章 绪论9-20

1.1 丙型肝炎病毒探讨进展9-14

1.1 丙型肝炎病毒基因组结构和蛋白功能9-10

1.2 丙型肝炎病毒生活周期10-11

1.3 丙型肝炎传播途径11

1.4 丙型肝炎病毒流行近况11-12

1.5 抗丙型肝炎药物研发的最新进展12-14

1.2 丙型肝炎病毒非结构蛋白 NS2 的功能介绍14-15

1.3 核酸适体及其在病毒探讨中的运用15-19

1.3.1 SELEX 技术的原理及工作流程15-16

1.3.2 核酸适体的优点16-17

1.3.3 核酸适体在病毒探讨中的运用17-19

1.4 本课题探讨的案例和目的19-20

第2章 丙型肝炎非结构蛋白 NS2 的原核表达20-31

2.1 前言20

2.2 材料与策略20-27

2.1 实验材料20-21

2.2 实验策略21-27

2.3 实验结果27-29

2.3.1 重组质粒 pET28b-NS2 的获得及鉴定27-28

2.3.2 NS2 蛋白的诱导表达28-29

2.4 小结与讨论29-31

第3章 丙型肝炎病毒非结构蛋白 NS2 核酸适体的筛选31-38

3.1 前言31

3.2 材料与策略31-34

3.

2.1 实验材料31-32

3.

2.2 实验策略32-34

3.3 实验结果34-37

3.1 蛋白的固定34-35

3.2 特异性识别 NS2 蛋白的单链 DNA 核酸适体浅析35-37

3.4 小结与讨论37-38

第4章 特异性识别结合丙型肝炎病毒非结构蛋白 NS2 的核酸适体对病毒生活周期的影响38-47

4.1 前言38

4.2 材料与策略38-42

4.

2.1 实验材料38-39

4.

2.2 实验策略39-42

4.3 实验结果42-45
4.

3.1 NS2 aptamers 抑制 FL 细胞中 HCV 的复制42-43

4.3.2 NS2 aptamers 抑制 Huh7.

5.5 细胞中 HCV 的复制和释放43-45

4.

3.3 NS2 aptamers 对 FCA1 细胞中 HCV 的影响45

4.4 小结与讨论45-47
结论47-48
参考文献48-56
致谢56-57
附录 攻读学位期间参与项目及发表论文57