探索层析伞枝犁头霉AbsidiacorymbiferaAS2生物转化富集黄芪甲苷学术

论文导读：含量是原料中的3倍。产物黄芪甲苷主要集中在发酵上清液中,经D101大孔吸附树脂分离纯化后,总回收率最高达到了62%,产品色谱纯度达到95%以上。该发酵及纯化工艺黄芪甲苷收率高,成本低,操作简便,避开利用有机溶剂,有利于其工业化生产。2、本探讨对黄芪总皂苷中可能转化为黄芪甲苷的前体化合物进行了浅析。采取常规硅胶柱和反相硅
摘要：黄芪甲苷(ASI)是中药黄芪中一种具有多种药理活性的皂苷类化合物,为黄芪制剂质量鉴定的指标成分。黄芪甲苷生物活性突出,中药一类新药“黄芪甲苷葡萄糖注射液”作为治疗缺血性心肌炎的药物正在进行Ⅲ期临床探讨。但由于黄芪甲苷结构复杂,无法进行化学全合成,由此其来源主要依靠以黄芪植物中提取。而其在黄芪中含量又非常低,需要大量植物资源和有机溶剂,使大规模制备成为瓶颈。微生物转化反应具有专一性强、污染少和转化率高的优点,广泛用于天然产物的结构改造。本探讨在国家重大科技专项(2009ZX09301-011)的资助下,借鉴前人的探讨经验,采取微生物转化富集技术,以黄芪总皂苷作为底物,通过发酵转化提升黄芪甲苷含量。主要内容是以筛选菌种开始,建立了发酵转化和以发酵液中分离提取黄芪甲苷的新策略,并成功分离获得新的关键酶—黄芪皂苷去乙酰化酶。此外,通过对可转化为黄芪甲苷的前体化合物的鉴定和转化探讨,假设了一条全新的微生物去乙酰化富集黄芪甲苷的途径。具体探讨结果如下：1、本探讨首先以不同来源的霉菌中筛选到能够高效转化黄芪总皂苷生成黄芪甲苷的菌种—Absidia corymbifera AS2。以黄芪总皂苷为底物,在投料浓度为5g/L的情况下,转化60h,转化率最高达到90.3%,黄芪甲苷的含量是原料中的3倍。产物黄芪甲苷主要集中在发酵上清液中,经D101大孔吸附树脂分离纯化后,总回收率最高达到了62%,产品色谱纯度达到95%以上。该发酵及纯化工艺黄芪甲苷收率高,成本低,操作简便,避开利用有机溶剂,有利于其工业化生产。2、本探讨对黄芪总皂苷中可能转化为黄芪甲苷的前体化合物进行了浅析。采取常规硅胶柱和反相硅胶柱分离的策略,并以A. corymbifera AS2微生物转化为指导,进行前体化合物的分离和确认,最终共分离到4个可转化为黄芪甲苷的皂苷类化合物。经结构鉴定4个前体化合物分别是astragaloside Ⅰ (AS-Ⅰ), isoastragaloside Ⅰ (isoAS-Ⅰ), astragaloside Ⅱ (AS-Ⅱ)和isoastragaloside Ⅱ (isoAS-Ⅱ)。通过ELSD检测与DAD扫描相结合的策略对四个前体化合物进行纯度鉴定,并采取ELSD吸收图谱的归一化法对四个标准品的纯度进行标定,结果分别为AS-Ⅰ(97%)、isoAS-Ⅰ(97.4%).AS-Ⅱ(98论文导读：(2'4'-di-OAc)比黄芪甲苷多两个乙酰基；AS-Ⅱ(2'-OAc)和isoAS-Ⅱ(3'-OAc)比黄芪甲苷多一个乙酰基。这些结构均可完全被A.corymbiferaAS2转化为黄芪甲苷,提示该菌株可能有着去乙酰化酶。为了进一步探讨微生物转化黄芪总皂苷生成黄芪甲苷的机制,本探讨继续对该微生物中可能有着的去乙酰化酶进行分离纯化。首先采取硫酸铵分步沉
%)和isoAS-Ⅱ(98.7%).建立了黄芪甲苷和4个前体化合物HPLC浅析策略和标准曲线,通过对发酵转化以及酶转化历程的实时浅析,进行代谢途径的探讨。3、以化学结构浅析来看,AS-Ⅰ(2'3'-di-OAc)和isoAS-Ⅰ(2'4'-di-OAc)比黄芪甲苷多两个乙酰基；AS-Ⅱ(2'-OAc)和isoAS-Ⅱ(3'-OAc)比黄芪甲苷多一个乙酰基。这些结构均可完全被A.corymbifera AS2转化为黄芪甲苷,提示该菌株可能有着去乙酰化酶。为了进一步探讨微生物转化黄芪总皂苷生成黄芪甲苷的机制,本探讨继续对该微生物中可能有着的去乙酰化酶进行分离纯化。首先采取硫酸铵分步沉淀法浓缩粗酶液中的目标蛋白,再进行Q-sepharose HP离子交换层析,在0.1mol/L氯化钠洗脱组份中发现了较高的酶活性。该组份经phenyl-sepharose6FF疏水层析,收集在0.7mol/L硫酸铵洗脱的活性组份继续进行CHT陶瓷型羟基磷灰石柱层析,在24.5mmol/L磷酸钾洗脱组份中发现有较高的活性。最后采取1mL Resource Q预装柱层析获得电泳纯的活性蛋白。酶活力回收率和蛋白回收率分别为0.32%和0.075‰。4、进一步对分离获得的黄芪皂苷去乙酰化酶进行酶学性质探讨。以p-NPA为底物在pH7.0和30℃条件下的动力学常数：米氏常数Km值为3.76mmol/L;最大反应速率Vmax为1.64mmol/min/mg.以p-NPA为底物的最适反应pH为8.0,在pH7.0-9.5范围内稳定；最适反应温度为35-45℃；在小于45℃温度范围内相对稳定。MS检测分子量为36067Da。采取SPITC修饰的PSD-MALDI质谱进行序列浅析,显示该酶可能为之前没有报道过的新酶。5、最后对黄芪皂苷去乙酰化酶的酶解途径进行探讨。结果显示4个前体化合物的转化途径分别是：AS-Ⅱ→ASI；isoAS-Ⅱ→AS-Ⅱ→ASI；AS-Ⅰ→(AS-Ⅱ、 isoAS-Ⅱ)→ASI:isoAS-Ⅰ→AS-Ⅱ→ASI.关键词：微生物转化论文黄芪甲苷论文Absidia论文corymbifera论文柱层析论文去乙酰化酶论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。论文导读：定35-403.5前体化合物的微生物发酵转化40-423.6微生物转化探讨42-473.7黄芪甲苷的结构鉴定47-483.8代谢途径探讨48-50小结50-51第二部分伞枝犁头霉(A.corymbiferaAS2)中黄芪皂苷去乙酰化酶的分离纯化、酶学性质及酶转化机制探讨51-78第一章AcorymbiferaAS2中黄芪皂苷去乙酰化酶的分离纯化51-65

1.实验材料51-541药

摘要7-10
Abstract10-13
縮略词说明13-14
前言14-18
第一部分 伞枝犁头霉(A.corymbifera AS2)生物转化制备黄芪甲苷策略的建立18-51
1 实验材料18-20

1.1 药品与试剂18-19

1.2 菌种及来源19

1.3 培养基配方19-20

1.4 主要仪器与设备20

2 实验策略20-27

2.1 菌种的定向筛选20

2.2 浅析策略20-23

2.3 黄芪甲苷转化前体化合物的确定和纯化23-24

2.4 前体化合物结构鉴定24

2.5 底物制备24

2.6 5L摇瓶发酵转化24-25

2.7 发酵液中产物的分布25

2.8 菌体浸泡实验25

2.9 发酵产物的纯化工艺25-26

2.10 发酵产物黄芪甲苷结构鉴定26

2.11 转化途径探讨26-27

3 实验结果27-50

3.1 菌种的定向筛选27

3.2 浅析策略27-30

3.3 黄芪甲苷转化前体的确认30-35

3.4 前体化合物的结构鉴定35-40

3.5 前体化合物的微生物发酵转化40-42

3.6 微生物转化探讨42-47

3.7 黄芪甲苷的结构鉴定47-48

3.8 代谢途径探讨48-50

小结50-51
第二部分 伞枝犁头霉(A.corymbifera AS2)中黄芪皂苷去乙酰化酶的分离纯化、酶学性质及酶转化机制探讨51-78
第一章 Acorymbifera AS2中黄芪皂苷去乙酰化酶的分离纯化51-65

1. 实验材料51-54

1.1 药品与试剂51-52

1.2 仪器与设备52

1.3 溶液52-54

2. 策略54-57

2.1 去乙酰化酶活力的测定54

2.2 粗酶液的制备54

2.3 黄芪皂苷去乙酰化酶的分离纯化54-56

2.4 蛋白含量测定56

2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳56-57

3. 结果与浅析57-64

3.1 菌体破壁效果检测57

3.2 粗酶液预处理57-58

3.3 去乙酰化酶的分离纯化58-64

小结64-65
第二章 A.corymbifera AS2中黄芪皂苷去乙酰化酶的探讨65-78

1. 实验材料65

1.1 药品与试剂65

1.2 缓冲液65

2. 实验策略65-68

2.1 去乙酰化酶活力的测定65-66

2.2 酶分子量的测定66

2.3 pH对酶活力和酶稳定性的影响66-67

2.4 温度对酶活力和酶稳定性的影响67

2.5 酶动力常数的确定67

2.6 黄芪皂苷转化活性论文导读：.4部分氨基酸序列浅析70-723.5酶对前体化合物转化机制探讨72-76小结76-78总结展望78-81参考文献81-87综述黄芪甲苷的探讨进展87-101参考文献96-101论文发表情况101-102致谢102-103附图103-126上一页1234
的检测67

2.7 部分氨基酸序列浅析67-68

3. 结果与浅析68-76

3.1 黄芪皂苷去乙酰化酶分子量的测定68

3.2 pH和温度对酶活力和酶稳定性的影响68-70

3.3 黄芪皂苷去乙酰化酶的动力学常数70

3.4 部分氨基酸序列浅析70-72

3.5 酶对前体化合物转化机制探讨72-76

小结76-78
总结展望78-81
参考文献81-87
综述 黄芪甲苷的探讨进展87-101
参考文献96-101
论文发表情况101-102
致谢102-103
附图103-126