研讨牙周炎高糖、糖基化终产物刺激下人牙周膜成纤维细胞生物学性能变化体外

论文导读：
摘要：探讨目的：通过观察高糖、糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）等不同的刺激作用下对人牙周膜成纤维细胞(human periodontalpgament fibroblasts，hPDLFs)增殖和凋亡情况及对IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ表达水平的影响，并利用RT-PCR（reverse transcriptase-polymerase chainreaction，RT-PCR）策略检测细胞NF-κB的表达水平，初步了解糖尿病患者牙周组织局部AGEs对患者牙周组织局部破坏的机制，并与单纯的高糖刺激比较，试图证明AGEs对牙周组织破坏和抑制修复的作用是更为关键的影响因素与机制，以期为临床治疗糖尿病伴慢性牙周炎患者提供可靠的基础论述依据。探讨策略：选取因正畸治疗而拔除的前磨牙，体外分离培养人牙周膜成纤维细胞，采取浓度为100μg/mlAGEs分别与高、低葡萄糖DMEM培养液混合，设立四个细胞组，L组为阴性对照组（5.5mmol/L葡萄糖）、H组为高糖组（25mmol/L葡萄糖）、L+A组（低糖+100μg/mlAGEs组）、H+A组（高糖+100μg/mlAGEs组）。设立12、24和36h三个时间点，分别采取CCK-8法、流式细胞仪检测人牙周膜成纤维细胞在不同刺激下细胞增殖及凋亡的情况；利用酶联免疫吸附法检测不同刺激下人牙周膜成纤维细胞IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ的表达水平，及相同时间不同AGEs浓度梯度（10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）下IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ的表达水平；利用RT-PCR检测各组细胞NF-κB mRNA的表达。利用SPSS19.0软件对数据进行方差浅析检验，实验结果以±s表示，p0.05为有统计学作用。探讨结果：1.不同刺激对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响1)细胞生长曲线人牙周膜成纤维细胞在四种不同培养基条件下，高糖、AGEs均能抑制细胞的增殖，其中H+A组细胞生长速度最为缓慢。2)细胞周期四组细胞增殖能力相互比较均有统计学作用（p0.05），H+A组抑制细胞增殖能力最强。2.不同刺激时间各组细胞IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ的表达及相同时间不同AGEs浓度梯度下IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ的表达水平。1)不同刺激时间各组细胞IL-1β的表达a组内比较：L组各时间点相互比较IL-1β的表达均无统计学作用（p0.05）；H组24h和36h与12h比较IL-1β的表达均有统计学作用（p0.05）；L+A组各时间点比较IL-1β的表达均有统计学作用（p0.05）；H+A组36h与12h、24h比较IL-1β的表达均有统计学作用（p0.05）。b组间比较：12h时，除H组和L+A组比较无统计学作用外，其余各组相互比较IL-1β的表达均有统计学作用（p0.05）；24h时，除L+A组和H+A组比较IL-1β的表达无统计学作用外，其余各组相互比较IL-1β的表达均有统计学作用（p0.05）；36h各组相互比较IL-1β的表达均有统计学作用（p0.05）。2)不同刺激时间各组细胞IL-6的表达a组内比较：L组组内各时间点比较IL-6的表达均无统计学作用(p0.05)；H组组内各时间点比较IL-6的表达均无统计学作用(p0.05)；L+A组组内各时间点比较IL-6的表达均有统计学作用(p0.05)；H+A组组内各时间点比较IL-6的表达均有统计学作用(p0.05)。b组间比较：12h时除L+A组和H+A组比较IL-6的表达无统计学作用(p0.05)，其余各组比较均有统计学作用(p0.05)；24h时除L+A组与H+A组比较IL-6的表达无统计学作用(p0.05)，其余各组比较均有统计学作用(p0.05)；36h时各组比较IL-6的表达均有统计学作用(p0.05)。3)不同刺激时间各组细胞TNF-的表达a组内比较：L组各时间点比较TNF-的表达均无统计学作用(p0.05)；H组除12h和24h比较TNF-的表达无统计学作用，其余时间点比较均有统计学作用(p0.05)；L+A组除12h和24h比较TNF-的表达无统计学作用，其余时间点比较均有统计学作用(p0.05)；H+A组各时间点比较TNF-的论文导读：仪器362策略36-382.1收集上清36-372.2酶联免疫吸附法（ELISA）检测37-382.3统计学浅析383结果38-443.1不同刺激时间，各组细胞IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ的表达38-433.236h时不同浓度AGEs刺激下H+A组细胞因子的表达43-444讨论44-46实验三不同刺激对人牙周膜成纤维细胞凋亡及NF-ΚBMRNA表达的影响46-561材料
表达均有统计学作用(p0.05)。b组间比较：12h时L组和H组、L组和L+A组、L组和H+A组比较TNF-的表达有统计学作用(p0.05)；24h时除H组和L+A比较TNF-的表达无统计学作用，其余各组比较TNF-的表达均有统计学作用(p0.05)；36h时各组之间比较TNF-的表达均有统计学作用(p0.05)。4)不同刺激时间各组细胞IFN-γ的表达a组内比较：L组12h和36h时比较IFN-γ的表达有统计学作用(p0.05)；H组、L+A组、H+A组各时间点比较IFN-γ的表达均有统计学作用(p0.05)。b组间比较：各时间点各组间比较IFN-γ的表达均有统计学作用(p0.05)。5)相同时间不同浓度AGEs刺激下H+A组细胞因子的表达a IL-1β：100μg/ml AGEs时IL-1β的表达与10μg/ml、50μg/ml AGEs的IL-1β表达比较均有统计学作用(p0.05)；b IL-6：10μg/ml时IL-6的表达与100μg/ml时IL-6的表达比较有统计学作用(p0.05)。c TNF-：100μg/ml时TNF-的表达与10μg/ml、50μg/ml AGEs的TNF-表达比较均有统计学作用(p0.05)；d IFN-γ：各浓度之间比较IFN-γ的表达均有统计学作用(p0.05)。3.不同环境下人牙周膜成纤维细胞NF-κB mRNA的表达及凋亡的影响1) L组各时间点NF-κB的基因表达比较无统计学作用(p0.05)；2) H组36h时NF-κB基因表达显著高于12h、24h的NF-κB基因表达，有统计学作用（p0.05）；3) L+A组、H+A组各时间点NF-κB基因表达比较均有统计学作用（p0.05），且L+A组、H+A组NF-κB基因表达随时间的延长而增高，结果提示NF-κB的表达具有时间依赖性；4)在24h、36h时L+A组、H+A组的NF-κB基因表达均高于H组，差别有统计学作用（p0.05）。5) L+A组、H+A组可加速细胞的凋亡。结论：1. AGEs能够显著的抑制人牙周膜成纤维细胞增殖。2. AGEs能够刺激人牙周膜成纤维细胞高表达IL-1β、IL-6、TNF-、IFN-γ，并与时间和浓度呈一定的依赖性。3. AGEs能够上调人牙周膜成纤维细胞的NF-κB表达并呈一定时间依赖性。4. AGEs可加速人牙周膜成纤维细胞的凋亡。关键词：牙周炎论文糖尿病论文人牙周膜成纤维细胞论文糖基化终产物论文
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中文摘要9-14
Abstract14-18
前言18-20
文献回顾一20-23
文献回顾二23-26
实验

一、不同刺激对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响26-35

1 实验材料26-27

1.1 主要试剂26

1.2 主要器械26-27

1.3 主要仪器27

2 实验策略27-31

2.1 人牙周膜细胞原代培养27-28

2.2 培养基的配制28-29

2.3 糖基化终产物的制备29

2.4 实验分组29-30

2.5 CCK-8 法检测细胞生长曲线30

2.6 检测细胞周期30-31

2.7 统计学浅析31

3 实验结果31-33

3.1 CCK-8 法细胞生长曲线的变化32

3.2 流式细胞周期32-33

4 讨论33-35
实验

二、不同刺激对人牙周膜成纤维细胞炎症因子表达差别的比较35-46

1 材料35-36

1.1 主要试剂35

1.2 主要器械35-36

1.3 主要仪器36

2 策略36-38

2.1 收集上清36-37

2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测37-38

2.3 统计学浅析38

3 结果38-44
3.1 不同刺激时间，各组细胞 IL-1β、IL-

6、TNF- 、IFN-γ的表达38-43

3.2 36h 时不同浓度 AGEs 刺激下 H+A 组细胞因子的表达43-44
4 讨论44-46
实验

三、不同刺激对人牙周膜成纤维细胞凋亡及 NF-ΚBMRNA 表达的影响46-56

1 材料46-47

1.1 主要试剂46-47

1.2 主要器械47

1.3 主要仪器47

2 策略47-51

2.1 细胞凋亡47-48

2.2 RNA 的提取4论文导读：计学浅析513结果51-543.1流式细胞凋亡51-523.2紫外分光光度计定量52-533.3REALTIMEPCR扩增电泳图533.4ABI7500realtimesystemSDS软件浅析结果53-544讨论54-56小结56-57参考文献57-65附录65-71个人简历和探讨成果71-72致谢72上一页123
8-49

2.3 检测总 RNA 纯度49

2.4 cDNA 的合成49-50

2.5 引物设计50

2.6 荧光实时定量 PCR50-51

2.7 统计学浅析51

3 结果51-54

3.1 流式细胞凋亡51-52

3.2 紫外分光光度计定量52-53

3.3 REAL TIME PCR 扩增电泳图53

3.4 ABI 7500 real time system SDS 软件浅析结果53-54
4 讨论54-56
小结56-57
参考文献57-65
附录65-71
个人简历和探讨成果71-72
致谢72