探讨纯化中国被毛孢胞内多糖分离纯化与初步结构设计

论文导读：
摘要：冬虫夏草是我国传统的名贵中药材，具有多种药效，而多糖是其药理活性的物质基础之一。中国被毛孢(Hirsutella sinensis)是冬虫夏草的无性型,本课题以中国被毛孢菌丝体为原料，采取水提醇沉、有机溶剂洗涤的策略获取了粗多糖。对于粗多糖混杂的淀粉，采取α-淀粉酶或β-淀粉酶和异淀粉酶组合进行水解， DNS法检测酶解释放的还原糖产生，碘-碘化钾试剂检测淀粉残留，发现β-淀粉酶和异淀粉酶组合在30℃、pH4.8、料酶比=25:4(w/w)的条件下酶解6h或α-淀粉酶在57℃、pH5.8、料酶比=25:1的条件下酶解6h，可以将粗多糖中的淀粉去除干净。用DEAE-纤维素阴离子交换层析（2.6×50cm）的策略对去淀粉后的粗多糖进行初步的分离，用含有盐离子的Tris-Hcl缓冲液进行梯度洗脱，梯度分别设置为0%~15%~50%~100%三个阶段、2mL/管进行收集，用苯酚-硫酸法检测糖峰，分别在0%和0~15%的盐溶液梯度中获得两组主要多糖——HST-1和HST-2。HST-1进一步用硼酸-硼砂缓冲液梯度洗脱，在不含盐离子的缓冲液中洗脱得到单一的多糖峰（HSP-A1）和在0~15%盐溶液硼酸-硼砂缓冲液梯度中洗脱获得多糖峰（HSP-B1）。通过GPC探讨，分别用0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L等不同浓度的NaAc溶液洗脱，得到在0.005mol/LNaAc溶液的条件下糖峰的分离度最好；并运用GPC2000软件浅析在0.005mol/LNaAc溶液中洗脱的各个峰的分子量的大小，进而确定了下一步凝胶色谱分离所需凝胶条件——SephadexG-100。在运用SepHadex G-100，洗脱剂为0.005mol/LNaAc，流速为0.5mL/min,5mL/管进行收集，苯酚硫酸法检测的条件下对HSP-A1和HSP-B1根据分子量的大小进行进一步的纯化，在运用上面陈述的条件的基础上，这部分实验根据色谱柱的分辨率分为三个部分：第一部分是运用2.8×50cm色谱柱分别对HSP-A1和HSP-B1进行两次重复上样纯化，以HSP-A1和HSP-B1中分别分离纯化得到含糖量较高的糖峰HSN-A3和HSN-B1；第二部分是运用1.8×100cm色谱柱对HSN-A3和HSN-B1进一步纯化，得到HSN-A3和HSN-B1都只产生一个对称的多糖峰论文导读：H-4进行初步的结构浅析，根据GPC2000软件浅析结果表明，HSH-3的分子量为1.2×104Da，HSH-4的分子量为5.3kDa。其中HSH-4主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔百分比分别为6.62:1.00:1.27；是一种α-构型的吡喃型多糖；以α-1,3-糖苷键为主链、α-1,6-糖苷键为支链。综上所述HSH-4是一种以含甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主的，以α-1,
，说明两个样品的纯度都已经很高；第三部分是通过HPLC纯化，条件为TSK-GEL,G4000SW凝胶柱(7．5mmx300mm)，柱温25℃，用0.005mol/L的NaAc溶液洗脱，流速0.5mL/min，用示差检测仪进行检测记录图谱，并通过HPLC检测最终样品的纯度，最终获得两个单一的、峰形对称、纯度达95%以上的的纯品HSH-3和HSH-4。运用HPLC和化学衍生化策略联用、红外、Varian400NMR等浅析手段对HSH-4进行初步的结构浅析，根据GPC2000软件浅析结果表明，HSH-3的分子量为1.2×104Da，HSH-4的分子量为5.3kDa。其中HSH-4主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔百分比分别为6.62:1.00:1.27；是一种α-构型的吡喃型多糖；以α-1,3-糖苷键为主链、α-1,6-糖苷键为支链。综上所述HSH-4是一种以含甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主的，以α-1,3-糖苷键为主链、α-1,6-糖苷键为支链的吡喃型杂多糖。关键词：中国被毛孢论文多糖论文分离纯化论文结构浅析论文
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Abstract6-11
第一章 前言11-29

1.1 冬虫夏草生活史11-12

1.1 冬虫夏草生命周期11

1.2 虫草蝙蝠蛾生命周期11-12

1.3 冬虫夏草有性型12

1.4 冬虫夏草无性型12

1.2 冬虫夏草的存活近况12-13

1.3 冬虫夏草药理作用13-18

1.3.1 免疫调节作用13-14

1.3.2 抗肿瘤作用14-15

1.3.3 抗氧化15-16

1.3.4 调节血糖作用16

1.3.5 保护肺的功能16-17

1.3.6 其它17-18

1.4 冬虫夏草活性成分18-20

1.4.1 核苷类化合物18

1.4.2 多糖类成分18-19

1.4.3 甾醇及糖醇类成分19

1.4.4 氨基酸成分19-20

1.4.5 其它成分20

1.5 多糖探讨20-27

1.5.1 多糖的提取21

1.5.2 多糖的分离纯化策略21-22

1.5.3 多糖的结构浅析22-25

1.5.3.1 化学策略22-23

1.5.3.2 色谱学策略23-24

1.5.3.论文导读：

3 波谱学策略24-25

1.5.4 冬虫夏草多糖结构目前探讨近况25-26

1.5.5 多糖结构探讨有着的不足26-27

1.6 课题探讨的目的与作用27-28

1.7 采取的探讨策略和技术路线28-29

第二章 材料与策略29-42

2.1 材料与仪器29-31

2.

1.1 仪器29

2.

1.2 主要材料和试剂29-30

2.

1.3 溶液配制策略30-31

2.2 策略31-42

2.1 去除脂类等物质31

2.2 中国被毛孢孢内多糖的提取31-32

2.3 粗多糖的洗涤32

2.4 去除淀粉策略探讨32-33

2.4.1 标准曲线的制定32

2.4.2 用β - 淀粉酶和异淀粉酶去除淀粉32

2.4.3 用α -淀粉酶去除淀粉32-33

2.5 脱去盐离子和小分子33

2.6 Tris- Hc l 缓冲液 DEAE - 52 纤维柱分离层析33-35

2.6.1 Tris- Hcl 缓冲液 DEAE - 52 纤维素预实验33-34

2.6.2 Tris- Hcl缓冲液DEAE- 52 分离层析制备柱实验34-35

2.7 SephadexG- 5 脱盐35

2.8 硼酸 -硼砂缓冲液 DE AE - 52 纤维素分离层析35-37

2.2.8.1 样品 A 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE - 52 纤维素分离预实验35-36
2.2.8.2 样品 A 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE -52 分离层析制备柱实验36
2.2.8.3 样品 B 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE - 52 纤维素分离预实验36-37
2.2.8.4 样品 B 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE - 52 分离层析制备柱实验37

2.9 GP C 实验37-38

2.9.1 样品的配制37-38

2.9.2 色谱柱的条件38

2.9.3 检测38

2.10 两次 8×50c m柱子SephadexG- 100 分离层析38

2.2.11

1.8×100c m 柱子SephadexG- 100 分离层析38-39

2.2.12 GP C 分离39

2.13 HSH- 4 和 HSH-3 分子量的测定39

2.14 HSH- 4 单糖组成浅析39-40

2.14.1 单糖标准品的衍生化39-40

2.14.2 样品衍生化40

2.14.3 HPLC 浅析条件40

2.2论文导读：43.61.8×100cm柱子SephadexG-100分离层析54-553.7HPLC分离结果553.8纯度鉴定55-573.9HSH-4和HSH-3分子量573.10讨论57-60第四章中国被毛孢胞内多糖（HSH-4）的初步结构浅析60-654.1HSH-4单糖组成60-614.2HSH-4红外光谱浅析结果614.3NMR浅析结果61-634.4讨论63-65致谢65-66参考文献66-71
.15 红外光谱结构浅析40-41

2.16 核磁共振结构浅析41-42

第三章 中国被毛孢胞内多糖的分离纯化42-60

3.1 去除淀粉42-44

3.2 透析44-45

3.3 离子交换层析45-50

3.1 Tris- Hcl 缓冲液离子交换层析结果45-46

3.2 SephadexG- 15 脱盐46-48

3.3 硼酸 -硼砂缓冲液离子交换层析结果48-50

3.4 GP C 探讨结果50-52

3.5 两次

2.8 × 50 cm柱子SephadexG- 100 分离层析结果52-54

3.6

1.8×100cm 柱子SephadexG- 100 分离层析54-55

3.7 HP L C 分离结果55

3.8 纯度鉴定55-57

3.9 HSH -4 和 HSH- 3 分子量57

3.10 讨论57-60

第四章 中国被毛孢胞内多糖（ HSH -4 ）的初步结构浅析60-65

4.1 HSH -4 单糖组成60-61

4.2 HSH -4 红外光谱浅析结果61

4.3 NMR 浅析结果61-63

4.4 讨论63-65

致谢65-66
参考文献66-71