浅论应激高脂血症合并急性脑缺血再灌注诱导大鼠肝损伤机制

论文导读：血2h再灌注24h后，用2,3,5氯化三四氮唑（triphenyltetrazopumchloride，TTC）染色法检测各组脑组织梗死面积，用Longa’s评分法对大鼠神经学行为进行评分，以评价MCAO模型是否成功。将脑梗死体积及神经功能评分结果与空白对照组相比有统计学差别（p0.05或p0.01）的大鼠纳入进一步的实验。

2.以血浆谷丙转氨酶（alanineaminotran

摘要：目的:探讨急性脑缺血损伤对高脂血症所致大鼠肝损伤的影响及机制。策略:1.实验分组：空白对照组（control）、单纯高脂血症组（hyperppemia, HL）、单纯脑缺血再灌注组(acute cerebral ischemia/reperfusion injury, I/R)及高脂血症合并脑缺血再灌注组（HL+I/R）。1.1建立大鼠高脂血症模型:对照组和I/R组以正常饲料喂养，HL组和HL+I/R组连续喂养高脂饲料18周，每天称量大鼠体重，每周取大鼠尾部静脉血液检测血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，观察高脂血症模型是否构建成功。1.2建立大鼠大脑中动脉局灶性缺血/再灌注(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型:将合格的高脂血症大鼠随机分为HL组及HL+I/R组，并对I/R组及HL+I/R组大鼠实施MCAO手术。脑缺血2h再灌注24h后，用2,3,5氯化三四氮唑（triphenyltetrazopumchloride，TTC）染色法检测各组脑组织梗死面积，用Longa’s评分法对大鼠神经学行为进行评分，以评价MCAO模型是否成功。将脑梗死体积及神经功能评分结果与空白对照组相比有统计学差别（p0.05或p0.01）的大鼠纳入进一步的实验。2.以血浆谷丙转氨酶（alanine aminotranerase, ALT）和谷草转氨酶（aspartateaminotranerase,AST）水平、肝脏切片HE染色，评价高脂血症和/或脑缺血再灌注对肝脏损伤状态的影响。3.以各组动物血清炎性细胞因子TNF-α和IL-1水平反映炎症状态；差速离心法分离肝脏线粒体及微粒体，检测线粒体超氧化物歧化酶（superoxide diutase，SOD）的活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）和Ca~(~(2+))的含量；测定肝微粒体细胞色素P4502E1(CYP2E1)依赖性苯胺羟化酶活性、免疫组化及Western blot法检测肝组织中CYP2E1的表达，以确定高脂血症大鼠在急性脑缺血再灌注状态下氧化还原系统的变化。4.TUNEL法检测肝细胞凋亡；免疫组化和Western blot法检测肝组织中凋亡相关因子bcl-2和caspase-3表达,以观察高脂血症合并缺血再灌注脑损伤对肝细胞凋亡的影响。结果:1.大鼠高脂血症合并缺血再灌注脑损伤模型构建：大鼠高脂饲料连续喂养18周后，高脂饲料喂养组大鼠体重、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白与空白对照组相比有显著差别（p0.05）;脑缺血2h再灌注24h后，I/R及HL+I/R组神经行为评分和脑梗死体积与空白对照组及HL组相比具有统计学差别（p0.05或p0.01），显示大鼠高脂血症及缺血再灌注脑损伤模型构建成功。2.与对照组相比，血清AST、ALT水平在HL组显著升高（p0.05或p0.01）；I/R组无显著变化；而HL+I/R组血清AST、ALT水平显著升高，与对照组、HL组和I/R组相比均有显著差别（p0.01），提示I/R加重HL所致大鼠肝损伤。（2）肝组织切片HE染色结果显示，对照组及I/R组肝组织无显著损伤，HL组肝细胞呈现脂肪浸润性病变，HL+I/R组肝组织损伤最为严重。3.炎症反应及肝脏氧化应激状态：（1）缺血2h再灌注24h后，HL和HL+I/R组的IL-1、TNF-α水平显著高于空白对照组，其中HL+I/R组的升高走势要大于HL组和I/R组（p0.05或p0.01）。（2）I/R组大鼠肝线粒体SOD活性与空白对照组相比呈下降的走势，Ca~(~(2+))水平呈上升走势（p0.05或p0.01）；HL和HL+I/R组肝线粒体SOD活性和GSH-PX含量较空白对照组有显著的降低，MDA和Ca~(~(2+))水平显著增高，其中HL+I/R组的变化较单纯高脂血症和缺血再灌注组更为显著（p0.05或p0.01）；HL组和I/R组大鼠肝组织CYP2E1活性及表达与空白组比较显著增强（p0.05或p0.01），HL+I/R组大鼠肝组织CYP2E1的表达变化显著高于HL组和I/R组（p0.05论文导读：
或p0.01)。4.细胞凋亡相关指标检测：（1）TUNEL法检测发现，空白对照组大鼠肝组织凋亡细胞数较少，I/R组偶见凋亡细胞，HL组和HL+I/R组的凋亡细胞都呈现不同程度的增加（p0.05或p0.01），其中HL+I/R组的凋亡细胞增加最为显著（p0.05或p0.01）；（2）免疫组化结果显示，与空白对照组比较，HL组和HL+I/R组中caspase-3表达水平显著增高，bcl-2的表达在这二者中则显著降低。Western blot的结果同样证明以上结论，caspase-3蛋白表达水平显著增高，bcl-2的蛋白表达则显著降低，HL+I/R组变化更加显著（p0.05或p0.01）。结论:在整体动物水平，证明了脑缺血再灌注能加重高脂血症引发的大鼠肝损伤,其机制与急性脑缺血再灌注增强CYP2E1诱导，进一步推动炎症反应、氧化应激及肝细胞凋亡历程有关。关键词：高脂血症论文脑缺血/再灌注论文氧化应激论文炎症反应论文凋亡论文肝损伤论文
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Abstract6-8
英文缩写对照表(Abbreviations)8-11
前言11-14
参考文献13-14
第一部分 急性脑缺血再灌注损伤对高脂血症诱导的大鼠肝损伤的影响14-23
1 材料与仪器14-15

1.1 试剂14-15

1.2 仪器15

2 策略15-18

2.1 实验动物及分组15-16

2.2 动物模型制备16

2.3 体重和血液生化指标的检测16

2.4 神经功能评分16-17

2.5 TTC 染色17

2.6 HE 染色17-18

2.7 统计学浅析18

3 结果18-20

3.1 大鼠血脂水平18

3.2 脑缺血再灌注损伤对高脂血症诱导大鼠肝损伤的影响18-20

4 讨论20-22
参考文献22-23
第二部分 脑缺血再灌注损伤对高脂血症诱导大鼠肝脏炎症反应及氧化应激的影响23-38
1 材料与仪器23-27

1.1 TNF-α、IL-1 检测相关试剂23

1.2 SOD、MDA、GSH-PX 和 Ca~(2+)检测相关试剂23-24

1.3 免疫组化相关试剂24

1.4 Western blot 浅析所用试剂24-27

1.5 仪器27

2 策略27-30

2.1 放射免疫法检测血清中 TNF-α、IL-1 的水平27-28

2.2 肝线粒体中 SOD 及 GSH-PX 活性、MDA、f水平的检测28

2.3 肝脏微粒体 CYP2E1 羟化酶活性的测定28

2.4 免疫组化浅析肝组织 CYP2E1 表达28-29

2.5 Western blot 浅析肝组织 CYP2E1 蛋白表达29-30

2.6 统计学浅析30

3 结果30-33

3.1 大鼠血清 TNF-α和 IL-1 表达水平30-31

3.2 大鼠肝线粒体 SOD 及 GSH-PX 活性、MDA 水平和 Ca~(2+)水平31-32

3.3 大鼠肝组织 CYP2E1 活性及表达水平32-33

4 讨论33-36
参考文献36-38
第三部分 脑缺血再灌注损伤对高脂血症诱导大鼠肝细胞凋亡的影响及机制38-51
1 材料与仪器38-42

1.1 TUNEL 法所用试剂38-39

1.2 免疫组化相关试剂39

1.3 Western blot 浅析所用试剂39-42

2 策略42-45

2.1 实验动物分组及模型制作42

2.2 TUNEL 法检测肝细胞凋亡42-43

2.3 免疫组化法检测肝组织 Bcl-2 和 Caspase-3 表达43

2.4 Western blot 法检测肝组织 Bcl-2 和 Caspase-3 表达43-45

2.5 统计学浅析45

3 结果45-47

3.1 TUNEL 法检测细胞凋亡45-46

3.2 免疫组化及 Western blot 法检测肝组织中 Bcl-2 和 Caspase-3 表达46-47
4 讨论47-49
参考文献49-51
结论51-52
综述52-57
参考文献55-57
在读期间科研活动与成果57-58
致谢58