探讨基因芯片双酚A对人胚胎干细胞拟胚体发育影响：初步基因组学
最后更新时间：2024-01-09
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论文导读：
摘要：探讨背景：大量探讨利用胚胎干细胞（Embronic stem cell,ES）的体外特性，以细胞毒性、分化抑制和基因表达等不同水平探讨胚胎发育及其调节，显示其良好的运用前景。ES悬浮培养后可自发形成拟胚体（Embryoid bodies,EB），分化为包括内胚层、中胚层和外胚层在内的多种类型细胞。EB基本再现了胚胎以原肠运动前到早期原肠运动这段时间的胚胎早期发育历程，并且便于进行各种操作处理，由此EB是探讨胚胎早期发育及其调节、遗传和表观遗传、胚层间相互诱导、器官空腔化形成、环境因素对胚胎早期发育的影响等课题的最佳实验模型。双酚A(Bisphenol A，BPA)作为一种重要的工业原料，广泛有着于塑料制品中，在哺乳动物体内有弱雌激素的活性BPA被广泛用于食品包装材料对人类的健康风险或潜在风险如何，是公众与政府密切关注的不足，也是近20年来持续的探讨热点。目前BPA的参考安全摄入剂量为每天50μg/kg，但近年来的动物实验表明即使低于安全摄入剂量，BPA对机体的影响仍然有着。BPA对人类胚胎早期发育的影响、遗传和表观遗传、及其与胎源性疾病的联系，正越来越受关注。本课题在我中心建立人类胚胎干细胞拟胚体培养系统，以EB为模型、运用基因组学技术，初步探讨BPA对胚胎早期发育的影响。本论文采取EB系统开展的探讨，避开了冲突带来的不便，通过对BPA影响人胚胎早期发育的相关基因表达谱的初步探讨，有助于增进对环境内分泌干扰物的探讨水平，以遗传和表观遗传学水平深入探讨BPA生殖遗传毒性的分子机制。探讨目的：1、在本中心建立人胚胎干细胞拟胚体培养平台，用于探讨人类早期胚胎发育及其调节。2、以人EB为模型，运用基因组学技术，初步探讨BPA对胚胎早期发育的影响，以遗传和表观遗传学水平探讨BPA生殖遗传毒性的分子机制。3、作为本课题组探讨BPA影响胚胎早期发育和生殖遗传学的一项探讨性探讨，为今后扩大样本量的实验、增加验证基因的实验、目标基因的功能探讨等工作奠定了基础。探讨策略:一、建立人胚胎干细胞拟胚体培养平台利用本实验室建立的多株人ES系，建立人EB模型。人ES克隆行P染色和TRA-1-81活细胞染色鉴定；通过RT-PCR策略和间接免疫荧光法检测人ES细胞标志性基因表达；检测人ES细胞染色体核型；ES细胞接种至SCID小鼠皮下，观察畸胎瘤形成情况。鉴定ES细胞系后，撤除胎鼠成纤维细胞铺层和碱性成纤维细胞生长因子悬浮培养ES克隆约7天，期间隔天换液，连续观察EB形成情况。培养7天后形成稳定的EB，EB鉴定是通过RT-PCR策略检测三胚层标志基因的表达。二、双酚A影响人EB早期发育的基因组学探讨ES细胞在无胎鼠成纤维细胞铺层和碱性成纤维细胞生长因子的悬浮条件下培养形成EB。实验组：EB形成历程中用10-6mol/L BPA处理；对照组：采取等量DMSO处理。形成EB（ES悬浮培养7天）后送检基因芯片，采取RocheNimbleGen真核生物表达谱芯片检测全基因组的表达谱，对差别基因利用网站(bioinfo.capitalbio.com/mas3/)浅析其功能、通路，分类GO注解。选择2个差别基因（PTN和FABP7）采取real-time PCR策略验证芯片结果。采取同法处理另一批EB，进一步验证由生物信息学所得的差别基因。为扩大样本量实验、增加验证基因、目标基因的功能探讨等工作，奠定了基础。结果：一、人胚胎干细胞拟胚体培养平台的建立1、实验室前期建立ES细胞呈克隆样形态生长，ES细胞碱性磷酸酶染色和活细胞多能因子TRA-1-81染色呈阳性并表达ES细胞特有的标志性基因，ES细胞具有正常二倍体核型和在SCID鼠体内形成畸胎瘤的能力，表明本实验室前期建立的ES系符合国际检测标准，适合用来形成EB；2、生长良好、大小基本一致的ES克隆块于未加bFGF因子的ES培养液中悬浮，定期换液观察，可见批量EB形成；3、获得EB边缘规整，形态呈圆球状，中间隐约可见囊腔。表达人三个胚层标志基因（AFP/BMP4/Nestin）。二、双酚A作用于人胚胎干细胞拟胚系统统的基因组表达谱双酚A实验组与DMSO对照组相比，在经10-6mol/L BPA处理7天后的拟胚体中表达上调2倍及以上的基因共有128个，表达下调2倍及以上的基因共有431个。利用生物分子功能论文导读：
注释系统（Molecule Annotation System，MAS）对这些差别表达基因进行功能浅析，发现它们与细胞分化、分子功能、胚层发育及信号传导通路相关。经扩大样本后验证发现双酚A可下调与神经系统发育相关的基因PTN和FABP7。结论：1、在本中心成功建立人胚胎干细胞拟胚体培养平台、EB鉴定的技术平台。2、ES悬浮培养后可自发形成拟胚体，分化为包括内胚层、中胚层和外胚层在内的多种类型细胞，是探讨人类早期胚胎发育及其调节的理想工具。3、本论文探讨性地探讨了BPA影响人胚胎早期发育的表达基因组学转变。双酚A作用于拟胚体，有128个基因表达上调，431个基因表达下调，涉及细胞分化、分子功能、胚层发育及信号传导通路等细胞功能和细胞事件，如PTN和FABP7与神经系统发育相关。4、本论文仅为系列探讨的一部分，但初步的实验为课题组今后扩大样本量的实验、增加验证基因的实验、设计更合适的BPA处理浓度和处理时间、目标基因的功能探讨、BPA对胚胎早期发育表观遗传学影响等探讨工作奠定了基础。关键词：双酚A论文人胚胎干细胞拟胚体论文基因芯片论文神经发育论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。中文摘要5-8
英文摘要8-11
前言11-13
第一部分 体外培养人胚胎干细胞拟胚体13-28
参考文献44-49
附表
参考文献94-103
攻读学位期间论文发表情况103-104
致谢104
摘要：探讨背景：大量探讨利用胚胎干细胞（Embronic stem cell,ES）的体外特性，以细胞毒性、分化抑制和基因表达等不同水平探讨胚胎发育及其调节，显示其良好的运用前景。ES悬浮培养后可自发形成拟胚体（Embryoid bodies,EB），分化为包括内胚层、中胚层和外胚层在内的多种类型细胞。EB基本再现了胚胎以原肠运动前到早期原肠运动这段时间的胚胎早期发育历程，并且便于进行各种操作处理，由此EB是探讨胚胎早期发育及其调节、遗传和表观遗传、胚层间相互诱导、器官空腔化形成、环境因素对胚胎早期发育的影响等课题的最佳实验模型。双酚A(Bisphenol A，BPA)作为一种重要的工业原料，广泛有着于塑料制品中，在哺乳动物体内有弱雌激素的活性BPA被广泛用于食品包装材料对人类的健康风险或潜在风险如何，是公众与政府密切关注的不足，也是近20年来持续的探讨热点。目前BPA的参考安全摄入剂量为每天50μg/kg，但近年来的动物实验表明即使低于安全摄入剂量，BPA对机体的影响仍然有着。BPA对人类胚胎早期发育的影响、遗传和表观遗传、及其与胎源性疾病的联系，正越来越受关注。本课题在我中心建立人类胚胎干细胞拟胚体培养系统，以EB为模型、运用基因组学技术，初步探讨BPA对胚胎早期发育的影响。本论文采取EB系统开展的探讨，避开了冲突带来的不便，通过对BPA影响人胚胎早期发育的相关基因表达谱的初步探讨，有助于增进对环境内分泌干扰物的探讨水平，以遗传和表观遗传学水平深入探讨BPA生殖遗传毒性的分子机制。探讨目的：1、在本中心建立人胚胎干细胞拟胚体培养平台，用于探讨人类早期胚胎发育及其调节。2、以人EB为模型，运用基因组学技术，初步探讨BPA对胚胎早期发育的影响，以遗传和表观遗传学水平探讨BPA生殖遗传毒性的分子机制。3、作为本课题组探讨BPA影响胚胎早期发育和生殖遗传学的一项探讨性探讨，为今后扩大样本量的实验、增加验证基因的实验、目标基因的功能探讨等工作奠定了基础。探讨策略:一、建立人胚胎干细胞拟胚体培养平台利用本实验室建立的多株人ES系，建立人EB模型。人ES克隆行P染色和TRA-1-81活细胞染色鉴定；通过RT-PCR策略和间接免疫荧光法检测人ES细胞标志性基因表达；检测人ES细胞染色体核型；ES细胞接种至SCID小鼠皮下，观察畸胎瘤形成情况。鉴定ES细胞系后，撤除胎鼠成纤维细胞铺层和碱性成纤维细胞生长因子悬浮培养ES克隆约7天，期间隔天换液，连续观察EB形成情况。培养7天后形成稳定的EB，EB鉴定是通过RT-PCR策略检测三胚层标志基因的表达。二、双酚A影响人EB早期发育的基因组学探讨ES细胞在无胎鼠成纤维细胞铺层和碱性成纤维细胞生长因子的悬浮条件下培养形成EB。实验组：EB形成历程中用10-6mol/L BPA处理；对照组：采取等量DMSO处理。形成EB（ES悬浮培养7天）后送检基因芯片，采取RocheNimbleGen真核生物表达谱芯片检测全基因组的表达谱，对差别基因利用网站(bioinfo.capitalbio.com/mas3/)浅析其功能、通路，分类GO注解。选择2个差别基因（PTN和FABP7）采取real-time PCR策略验证芯片结果。采取同法处理另一批EB，进一步验证由生物信息学所得的差别基因。为扩大样本量实验、增加验证基因、目标基因的功能探讨等工作，奠定了基础。结果：一、人胚胎干细胞拟胚体培养平台的建立1、实验室前期建立ES细胞呈克隆样形态生长，ES细胞碱性磷酸酶染色和活细胞多能因子TRA-1-81染色呈阳性并表达ES细胞特有的标志性基因，ES细胞具有正常二倍体核型和在SCID鼠体内形成畸胎瘤的能力，表明本实验室前期建立的ES系符合国际检测标准，适合用来形成EB；2、生长良好、大小基本一致的ES克隆块于未加bFGF因子的ES培养液中悬浮，定期换液观察，可见批量EB形成；3、获得EB边缘规整，形态呈圆球状，中间隐约可见囊腔。表达人三个胚层标志基因（AFP/BMP4/Nestin）。二、双酚A作用于人胚胎干细胞拟胚系统统的基因组表达谱双酚A实验组与DMSO对照组相比，在经10-6mol/L BPA处理7天后的拟胚体中表达上调2倍及以上的基因共有128个，表达下调2倍及以上的基因共有431个。利用生物分子功能论文导读：
注释系统（Molecule Annotation System，MAS）对这些差别表达基因进行功能浅析，发现它们与细胞分化、分子功能、胚层发育及信号传导通路相关。经扩大样本后验证发现双酚A可下调与神经系统发育相关的基因PTN和FABP7。结论：1、在本中心成功建立人胚胎干细胞拟胚体培养平台、EB鉴定的技术平台。2、ES悬浮培养后可自发形成拟胚体，分化为包括内胚层、中胚层和外胚层在内的多种类型细胞，是探讨人类早期胚胎发育及其调节的理想工具。3、本论文探讨性地探讨了BPA影响人胚胎早期发育的表达基因组学转变。双酚A作用于拟胚体，有128个基因表达上调，431个基因表达下调，涉及细胞分化、分子功能、胚层发育及信号传导通路等细胞功能和细胞事件，如PTN和FABP7与神经系统发育相关。4、本论文仅为系列探讨的一部分，但初步的实验为课题组今后扩大样本量的实验、增加验证基因的实验、设计更合适的BPA处理浓度和处理时间、目标基因的功能探讨、BPA对胚胎早期发育表观遗传学影响等探讨工作奠定了基础。关键词：双酚A论文人胚胎干细胞拟胚体论文基因芯片论文神经发育论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。中文摘要5-8
英文摘要8-11
前言11-13
第一部分 体外培养人胚胎干细胞拟胚体13-28
一、材料与策略13-21
二、结果21-23
三、讨论23-27
四、小结27-28
第二部分 双酚 A 对人胚胎干细胞拟胚体发育的影响：初步的基因组学探讨28-43一、材料与策略28-33
二、结果33-37
三、讨论37-42
四、小结42-43
总结43-44参考文献44-49
附表
1.基因芯片检测 BPA 处理组与 DMSO 对照组差别基因表49-75
综述：双酚 A 对男女生殖内分泌系统的影响及机制75-103参考文献94-103
攻读学位期间论文发表情况103-104
致谢104