试谈基因牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒全基因测序、表达与生物信息学学报

论文导读：lDiseaseVirus,BVDV/MDV）的病原学、血清学、流行病学进行了探讨，而对其分子生物学方面的探讨很少，因而对其展开分子生物探讨是十分必要的。本探讨运用现代分子生物学策略和手段，对牦牛株BVDV开展了系列探讨：一是首次成功地克隆测定了牦牛株BVDV的全基因序列；二是对其生物信息进行了浅析探讨；三是对其重要的E2蛋白进行了真
摘要：牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease, BVD/MD）是一种全球性病毒性传染病，可感染牛、羊、兔、鹿等多种动物，对养牛业的危害最为严重。1983年，王清江等首次确认牦牛群体中有着牦牛病毒性腹泻/粘膜病，但由于缺乏有效的防控措施和相应的疫苗，该病在牦牛群体中呈蔓延走势。长期以来，人们主要对牦牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（Bovine Viral DiarrheaVirus/Mucosal Disease Virus, BVDV/MDV）的病原学、血清学、流行病学进行了探讨，而对其分子生物学方面的探讨很少，因而对其展开分子生物探讨是十分必要的。本探讨运用现代分子生物学策略和手段，对牦牛株BVDV开展了系列探讨：一是首次成功地克隆测定了牦牛株BVDV的全基因序列；二是对其生物信息进行了浅析探讨；三是对其重要的E2蛋白进行了真核表达探讨。探讨结果如下：1.完成了牦牛株BVDV的全基因组序列测定通过将牦牛株BVDV的全基因组分为19个片段进行克隆，获得了全长为12305bp的全基因序列，并提交GenBank数据库，登录号为JQ799141。以BVDV3’末端共有保守碱基入手，设计了一条特殊下游引物，成功扩增牦牛株BVDV的全基因组的3’末端。将牦牛株BVDV全基因组序列与NADL(AJ133739)标准毒株进行比较浅析，在碱基932-937处多6个插入碱基（CAATCC），并确定其基因组的结构为5'UTR-P20（Npro）-P14（C）-gp48（E0）-gp25（E1）-gp53（E2）-P7-P125（NS2-3）-P10（NS4A）-P30（NS4B）-P58（NS5A）-P75（NS5B）-3'UTR，5'UTR结构中有8个ATG，3'UTR结构中8个核苷酸的重复序列（TATATATA），P125基因无外源序列插入，无基因缺失重排等现象。本探讨首次成功获得牦牛株BVDV全基因组序列，丰富了牦牛株BVDV病原分子生物学探讨的内容，为今后深入细致开展牦牛BVDV探讨奠定了坚实的基础。2.牦牛株BVDV全基因序列生物信息学浅析将牦牛株BVDV全基因序列与GenBank中登陆的其他8株BVDV病毒全基因序列进行同源性比对及系统发生浅析。结果表明牦牛株BVDV与其他8株BVDV毒株全基因序列同源性均不高，核苷酸同源性为68.9%-74.4%；进化树结果表明牦牛株BVDV与其他8株BVDV毒株在遗传进化联系上较远。虽然浅析发现牦牛株BVDV与其他8株BVDV毒株在结构蛋白的核苷酸、氨基酸序列及非编码区核苷酸序列有着一定的差别，且同源性不高，但通过抗原性的比对浅析，发现牦牛株BVDV结构蛋白抗原表位所处区域与其它8株BVDV参考毒株相似性很高，间接证明了结构蛋白基因在各BVDV毒株间具有一定的保守性。通过对牦牛株BVDV结构蛋白亲水性与抗原性峰值较高的区域浅析发现，其结构蛋白亲水性与抗原性成平行相关，且该结构蛋白具有四段高度疏水区，确保将结构蛋白锚定在BVDV囊膜上。3. E2蛋白成功在毕赤酵母GS115中得到表达利用毕赤酵母真核表达系统，成功对牦牛株BVDV的E2蛋白进行了真核表达。将去除跨膜区的牦牛株BVDV sE2基因克隆至pPIC9K表达载体上，成功构建了重组表达质粒pPIC9K-sE2。将真核表达质粒pPIC9K-sE2转化至制备的毕赤酵母GS115感受态细胞中，经过甲醇诱导，将表达产物通过SDS-PAGE与Western-blot检测。SDS-PAGE结果表明pPIC9K-sE2在毕赤酵母GS115中成功表达出大约45KDa的分泌蛋白；Western-blot结果表明，成功表达的E2蛋白具有良好的抗原性。首次成功将牦牛株BVDV E2蛋白在毕赤酵母真核表达系统进行表达，进一步丰富了牦牛株BVDV的病原分子生物学内容，为将来研发亚单位疫苗及诊断抗原奠定基础。关键词：牦牛病毒性腹泻病病毒论文全基因序列浅析论文生物信息学浅析论文E2基因的真核表达论文
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Abstr论文导读：牛株BVDV全基因与其他毒株的进化联系27-282.2牦牛株BVDV结构蛋白核苷酸序列和非编码区的序列剖析28-343讨论34-353.1牦牛株BVDV全基因组同源性浅析343.2牦牛株BVDV结构蛋白核苷酸序列浅析34-353.3牦牛株BVDV非编码区结构浅析354结论35-36第三章牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒E2基因的真核表达与鉴定36-521材
act5-11
第一章 牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒全基因测定与浅析11-26
1 材料与策略11-17

1.1 毒株、细胞及菌株11

1.2 主要试剂11-12

1.3 主要仪器12

1.4 牦牛株 BVDV 病毒增殖培养12

1.5 总 RNA 的提取及 cDNA 合成12-13

1.6 引物的设计与合成13

1.7 牦牛株 BVDV 各段基因的克隆13-15

1.8 牦牛株 BVDV3’-UTR 的扩增15-16

1.9 牦牛株 BVDV 全基因拼接及浅析16-17

2 实验结果17-23

2.1 新生犊牛睾丸细胞的制备及带毒检测17

2.2 牦牛株 BVDV 在细胞中增殖鉴定17-18

2.3 牦牛株 BVDV 全基因的扩增18

2.4 牦牛株 BVDV 全基因的序列测定及拼接18-20

2.5 牦牛株 BVDV 全基因结构情况20-21

2.6 牦牛株 BVDV 多聚蛋白氨基酸序列浅析21-23

3 讨论23-25

3.1 牦牛株 BVDV 全基因的扩增23

3.2 牦牛株 BVDV3’-UTR 的扩增23-24

3.3 牦牛株 BVDV 全基因结构特点24

3.4 牦牛株 BVDV 非致培养细胞病变型生物型的确定24-25

4 结论25-26
第二章 牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒全基因的生物信息学浅析26-36
1 材料与策略26-27

1.1 参考毒株26

1.2 生物信息学软件26

1.3 牦牛株 BVDV 全基因的生物信息学浅析26-27

2 结果27-34

2.1 牦牛株 BVDV 全基因与其他毒株的进化联系27-28

2.2 牦牛株 BVDV 结构蛋白核苷酸序列和非编码区的序列剖析28-34

3 讨论34-35

3.1 牦牛株 BVDV 全基因组同源性浅析34

3.2 牦牛株 BVDV 结构蛋白核苷酸序列浅析34-35

3.3 牦牛株 BVDV 非编码区结构浅析35

4 结论35-36
第三章 牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒 E2 基因的真核表达与鉴定36-52
1 材料与策略36-47

1.1 工程菌及克隆载体36

1.2 试剂36-38

1.3 仪器38

1.4 引物的设计与合成38-39

1.5 缺失跨膜区域的牦牛 BVDV sE2 基因的扩增及纯化39-41

1.6 sE2 基因重组真核表达载体的构建41-44

1.7 P.pastoris GS115 感受态细胞的制备44-45

1.8 牦牛株 BVDV sE2 基因的真核表达45-47

2 实验结果47-50

2.1 sE2 基因的扩增结果47

2.2 sE2 基因的克隆及鉴定结果47

2.3 牦牛株 BVDV sE2 基因重组真核表达载体的构建47-48

2.4 牦牛株 BVDV sE2 基因真核表达产物 SDS-PAGE 的检测结果48-49
2.5 牦牛株 BVDV sE2 基因真核表达产物的 Western-blot49-50
3 讨论50-51

3.1 表达 E2 蛋白的作用50

3.2 E2 基因跨膜区对表达的影响50

3.3 表达系统的选择50-51

4 结论51-52
第四章 文献综述52-60
1 病原学52-53
2 流行病学53-54
3 临床症状与病理变化54-55

3.1 急性病毒性腹泻54

3.2 粘膜病(Mucosaidisease，MD)54-55

3.3 免疫抑制55

4 牛病毒性腹泻诊断技术探讨进展55-58

4.1 病原学诊断策略55-57

4.2 血清学检测技术57-58

5 牛病毒性腹泻防治探讨进展58-60
参考文献60-65
发表论文65-66
致谢66-67