论通量细胞色素P4502C19稳定表达细胞系构建及其在中药筛选中初步

论文导读：实验依据。关键词：细胞色素论文P4502C19论文基因多态性论文荧光检测技术论文酶动力学浅析论文药物高通量筛选论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。符号说明6-7摘要7-10ABSTRACT10-13前言13-16第一章文献回顾16-2
摘要：目的：CYP2C19是细胞色素P450家族中重要的一类代谢酶，参与了众多临床药物的代谢。本探讨利用体外DNA重组技术、克隆构建CYP2C19野生型载体及2个突变型载体，并表达于人肝癌细胞（HepG2），建立稳定表达目的基因的稳转细胞系，建立一个探讨CYP2C19酶活性的高通量荧光检测技术平台。主要进行酶动力学浅析以及药物抑制高通量筛选，测定酶动力学常数和药物抑制常数，体外探讨细胞色素CYP2C19基因多态性外对药物代谢的影响。为探讨革新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。策略：提取人肝脏组织中mRNA，运用RT-PCR法以人肝脏cDNA文库中扩增出CYP2C19野生型基因（CYP2C19*1）序列，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-)，再以此为模板，体外定点突变PCR法构建*2、*3（突变型）载体，经菌落PCR,酶切以及测序鉴定后，经脂质体转染HepG2细胞，通过G4l8选择培养，建立稳定转染细胞系，RT-PCR，Western-Blot分别检测CYP2C19SNPs mRNA以及蛋白的表达。以CEC（3-cynao-7-ethoxycoumarin）作为CYP2C19特异性荧光底物进行酶学反应，检测CYP2C19SNPs活性，利用非线性回归策略计算酶促反应动力学参数Km值，Vmax值和内在清除率CLint值(Vmax/Km)。通过将特异性荧光底物CEC（浓度选取在Km值附近），待检测中药单体（浓度梯度以128到1uM等比稀释），以及其他用来模拟体内环境的相关实验条件相组合进行体外酶抑制反应，浅析待检测中药单体对CYP2C19SNPs的抑制效应，并计算其IC50值。本实验初步对105多种中药单体进行了初步筛选，并以中选取22种中药单体进行了深入探讨。结果：RT-PCR显示目的基因CYP2C19各SNP扩增良好，筛选的HepG2细胞系中均有各目的基因的表达，同时，Western-blotting印迹显示CYP2C19SNPs在该系统中得到了稳定的表达，成功获得了目的基因的表达蛋白。利用特异性荧光底物CEC直接与细胞孵育进行酶动力学反应，CYP2C19*1代谢CEC的酶促反应动力学参数Km值为17.3±1.093，Vmax值为86.8±4.518，CLint值为4.945±0.132；CYP2C19*2Km值为19.62±1.384，Vmax值为17.24±2.364，CLint值为0.847±0.086；CYP2C19*3Km值为15.21±2.271，Vmax值为9.93±0.479，CLint值为0.671±0.059。本实验所得数据与已有探讨报道结果相近。将CEC浓度固定在其Km值附近，采取细胞直接孵育法与CYP2C19已知特异性抑制剂反苯环丙胺系列浓度共同孵育，结果验证反苯环丙胺对CYP2C19*1有特异性的抑制作用，IC50约为7.73uM。运用荧光高通量检测技术对多态性等位酶和大约100种中药单体的抑制筛选实验表明：2C19参与代谢的底物和已知抑制剂均对其有抑制作用，多数中药单体对CYP2C19抑制作用微弱或者无抑制作用；化学结构或治疗作用类似的同类药品对CYP2C19的抑制情况不一；不同基因型被同一种药物抑制程度也不尽相同，甚至差别较大。结论：1、本探讨成功建立了CYP2C19体外稳定表达的细胞系，目的基因蛋白活性良好且表达稳定。2、测定验证了CYP2C19多态性体外药代动力学活性以及众多中药单体对其抑制作用的初步探讨。3、建立了高效、稳定、简便的荧光高通量药物筛选平台，为后期探讨CYP2C19运用于革新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测奠定了基础，为临床潜在药物相互作用提供前期实验依据。关键词：细胞色素论文P4502C19论文基因多态性论文荧光检测技术论文酶动力学浅析论文药物高通量筛选论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。符号说明6-7
摘要7-10
ABSTRACT10-13
前言13-16
第一章 文献回顾16-22
1.1 人肝细胞色素P45论文导读：40-413.2.2酶动力学浅析413.2.3反苯环丙胺对人重组CYP2C19野生株的抑制实验41-423.2.4药物高通量筛选42-433.3结果43-473.3.1酶促反应条件的优化与确定433.3.2酶促反应时间线性的确定43-443.3.3人重组CYP2C19基因多态性酶动力学浅析44-453.3.4反苯环丙胺对人重组CYP2C19野生型细胞株的抑制反应453.3.5药物高通量
0 酶探讨进展16-18

1.1 CYP450 酶的命名16

1.2 CYP450 酶的结构、分类及分布16

1.3 CYP450 酶对药物代谢的影响16-17

1.4 中药对细胞色素P450 影响的探讨进展17-18

1.2 CYP2C19 及其等位基因多态性探讨进展18-22

1.2.1 CYP2C19 位置及其结构19

1.2.2 CYP2C19 基因多态性及表型分布19-20

1.2.3 CYP2C19 参与代谢底物20

1.2.4 CYP2C19 基因多态性与药物代谢20-22

第二章 CYP2C19 基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立22-39

2.1 材料22-24

2.

1.1 主要试验试剂及耗材22

2.

1.2 主要试验仪器设备22-23

2.

1.3 主要试剂配制23-24

2.2 策略24-33

2.1 引物设计与合成24

2.2 人肝脏CYP2C19*1 cDNA的扩增24-25

2.3 目的基因野生型T载体的构件及测序鉴定25

2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（CaCl2 法）25-26

2.5 重组质粒的鉴定26

2.6 人肝脏CYP2C19 重组表达载体的构建及鉴定26-28

2.7 细胞培养及转染28

2.8 G418 筛选稳定表达目的基因的细胞株28-29

2.2.9 RT-PCR 检测各稳转细胞系 CYP2C19 SNPs mRNA 表达水平29-30
2.2.10 Western-Blott 检测各稳转细胞系 CYP2C19 SNPs 蛋白表达30-33

2.3 结果33-37

2.3.1 人肝脏中提取的CYP2C19*1 野生型mRNA33

2.3.2 pcDNA3.1(-)-CYP2C19 重组表达载体的构建33-34

2.3.3 稳定表达CYP2C19 各目的基因HepG2 细胞系鉴定34-37

2.4 讨论37-39

2.4.1 CYPs异源表达系统的选择37

2.4.2 表达产物的浅析37

2.4.3 重组CYPs的运用前景37-39

第三章 人重组CYP2C19 基因多态性酶动力学浅析及基于荧光的药物高通量筛选39-48

3.1 材料39-40

3.

1.1 主要主要试验试剂及耗材39

3.

1.2 主要试验仪器设备39

3.

1.3 主要试剂配制39-40

3.2 策略40-43
3.

2.1 酶促反应条件优化40-41

3.

2.2 酶动力学浅析41

3.

2.3 反苯环丙胺对人重组CYP2C19 野生株的抑制实验41-42

3.

2.4 药物高通量筛选42-43

3.3 结果43-47

3.1 酶促反应条件的优化与确定43

3.2 酶促反应时间线性的确定43-44

3.3 人重组CYP2C19 基因多态性酶动力学浅析44-45

3.4 反苯环丙胺对人重组CYP2C19 野生型细胞株的抑制反应45

3.5 药物高通量筛选45-47

3.4 讨论47-48

全文总结48-49
参考文献49-56
附图56-59
攻读学位期间主要的探讨成果59-60
致谢60-61