简析栓塞壳聚糖微球制备优化及其乙酰化微球作为潜在栓塞材料

论文导读：)的毒性，MEFs细胞能在稍小粒径(132μm、260μm)的两种微球上生长良好，而在大粒径(429μm)上无法生长，MEFs在CMs上的增殖率随着孵育时间的延长而降低，但在ACMs上增殖率随着孵育时间的延长而上升。通过蛋白吸附、血液相容性、细胞毒性实验表明ACMs具更好的血液相容性和细胞相容性。对两种微球进行体内生物安全性评价。材料浸提
摘要：经导管血管栓塞术(Transcatheter arterial embopzation, TAE)是在X射线下，经导管向靶血管内注入或送入栓塞物质，使血管闭塞以而达到预期治疗目的的技术。它通过阻塞血管血流，减少病灶或身体某个特定部位的血液供给达到治疗疾病目的。该技术具有微创性、全程影像引导和选择性靶血管插管技术，使得栓塞的准确性和可控性大大增强，成为革命性的临床治疗策略。微球因其栓塞效果好、对特定组织器官的靶向性高、可以与化疗药结合可缓释药物等优点，以而受到越来越多的关注，是目前常见的栓塞载体。壳聚糖(Chitosan)是甲壳质脱乙酰基后得到的一种天然阳离子多糖，化学名称为β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。具有良好的生物相容性、生物可降解性、天然无毒、抑菌性、抗肿瘤、增强免疫及抗氧化活性等，在医药、食品、农业、生化、化工、环保等诸多领域都有一定的运用价值。近年来以壳聚糖及其衍生物为原料的有关栓塞剂一直是探讨的热点，其既具有自身优良的生物学活性，又可以包载多种药物，起到物理栓塞和化学治疗双重作用。本论文以壳聚糖为原料，采取乳化-交联法制备壳聚糖微球(CMs)及乙酰化微球(ACMs)，检测其理化性质及生物相容性，利用乙酰化后的微球进行兔耳模拟栓塞实验检测栓塞效果，为临床运用奠定基础。采取O/W乳化交联法对现有的壳聚糖制备微球，通过单因素浅析法和响应面浅析法综合考察了壳聚糖浓度、乙酸浓度、Span80量、甲苯量、乳化转速、乳化时间、甲醛量和交联时间对微球制备的影响，通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验及Box-Behnken实验设计浅析各因素的主次效应、优化各因素水平，多次实验后得出微球制备工艺为：2%(w/v)壳聚糖用1.7%(v/v)的醋酸溶解，取100ml加入含7ml Span80和2ml tween-60的488ml甲苯中，1100rpm搅拌60min充分乳化，然后加入10ml甲醛溶液再搅拌60min进行固定，最后完成微球的制备。经重复实验得到微球实验值(8.03g)和论述值(7.93g)相差不大，所得微球表面光滑、球形完整、形状规则。经乙酰化CMs得到乙酰化壳聚糖微球(ACMs)，微球表面光滑、球形完整，分散良好。FT-IR显示ACMs在1595cm~(-1)处出现乙酰氨基特点吸收峰。壳聚糖、CMs、ACMs的脱乙酰度分别为90.57%、84.83%和20.92%，说明形成微球后有5.7%的氨基发生交联反应，之后又有63.9%的氨基被乙酰化。CMs溶胀率与pH值呈反比，ACMs溶胀率受pH值影响较小。同时，两种微球溶胀率受环境温度影响都很大，随着温度升高而增加。微球热稳定性良好，在121℃、150kPa加热1h无显著变化，室温静置3个月后，形态依然完整。ACMs在溶菌酶的作用下酶解速度大于CMs，8周后两者质量分别下降了58.1%和40.7%，降解后的微球表面凹凸不平、出现空腔。两种微球均能吸附BSA，由于CMs上氨基更多，所以蛋白吸附量比ACMs的大，达到吸附平衡时间也长。ACMs在低浓度(10mg/ml)和高浓度(50mg/ml)时溶血率均小于5%，而CMs在高浓度时显著溶血；ACMs所诱导的血栓形成反应较小，血栓量显著少于CMs，结果说明ACMs具有良好的血液相容性。MTT法比较了两种微球对胎鼠成纤维细胞(MEFs)的毒性，MEFs细胞能在稍小粒径(132μm、260μm)的两种微球上生长良好，而在大粒径(429μm)上无法生长，MEFs在CMs上的增殖率随着孵育时间的延长而降低，但在ACMs上增殖率随着孵育时间的延长而上升。通过蛋白吸附、血液相容性、细胞毒性实验表明ACMs具更好的血液相容性和细胞相容性。对两种微球进行体内生物安全性评价。材料浸提液无皮肤致敏性和刺激性，对兔眼角膜也无刺激性。以高剂量(0.5ml/10g)通过尾静脉注射比腹腔注射对动物的刺激略大，注射后24h时体重下降，但之后恢复正常，而腹腔注射对小鼠无影响，表明材料浸提液无潜在急毒性。将微球植入大鼠肌肉后，术后3d、7d、14d时对大鼠肝、肾功能无影响；但植入炎症反应导致WBC水平升高(P0.05)，7d后之后恢复正常；微球在体内逐渐被降解，没有引起显著的组织排异反应，有良好的组织相容性。ACMs栓塞兔耳动脉3d论文导读：
后，兔耳发炎水肿，耳尖由于血管被堵出现发黑、结痂现象；栓塞后7d，兔耳消肿，耳尖显著发黑、结痂、缺血性坏死；栓塞15d，耳尖部位小动脉萎缩消失，周围组织干性坏死，部分发生脱落，与坏死组织交界的边缘表皮萎缩增厚；结果表明ACMs有显著栓塞效果。检测了盐酸阿霉素(ADM HCl)载药微球的包封率、载药量及体外缓释行为。两种微球包封率和载药量分别为54.8±1.23%、11.1±0.61%，由于脱水作用，导致未干燥的CMs的药物包封率和载药量均高于干燥后的微球(分别为62.53%、13.67%)。载药微球体外释药探讨表明，两种载药微球在pH4.0介质中缓释率要在比在pH7.2介质中大，且ACMs缓释效果优于CMs，有着显著缓释作用。实验发现壳聚糖微球，尤其是乙酰化壳聚糖微球具有良好的血液相容性、细胞相容性、组织相容性，生物安全性高，栓塞效果显著，可以作为临床上潜在的血管栓塞材料。关键词：壳聚糖论文微球论文乙酰化论文栓塞剂论文介入治疗论文
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Abstract7-15
绪论15-40
1 壳聚糖概述15-25

1. 壳聚糖的活性作用16-19

1.2 壳聚糖作为药物缓释载体的类型19-23

1.3 壳聚糖微球制备策略23-25

2. 介入治疗与动脉栓塞术25-37

2.1 介入治疗25-27

2.2 经导管动脉栓塞术27

2.3 栓塞治疗运用范围27-30

2.4 栓塞材料30-34

2.5 动脉栓塞微球在介入治疗中的运用34-36

2.6 目前动脉栓塞微球不足和展望36-37

3 立题背景及探讨内容37-40

3.1 背景37-38

3.2 探讨内容38-39

3.3 技术路线39-40

第一章 单因素浅析法制备壳聚糖微球40-49
前言40

1. 材料40-41

1.1 材料与试剂40-41

1.2 主要仪器41

2. 策略41-42

2.1 壳聚糖微球的制备41

2.2 壳聚糖浓度的影响41

2.3 醋酸浓度的影响41

2.4 不同油相的影响41

2.5 不同 O/W 比例的影响41

2.6 乳化剂的影响41

2.7 交联剂及用量的影响41-42

3 结果与讨论42-47

3.1 壳聚糖浓度对微球制备的影响42-43

3.2 醋酸浓度对微球制备的影响43-44

3.3 不同油相对微球制备的影响44

3.4 不同 O/W 比例对微球制备的影响44-45

3.5 乳化剂对微球制备的影响45-46

3.6 交联剂的选择及用量对微球制备的影响46-47

4 结论47-49
第二章 响应面浅析法优化制备壳聚糖微球的探讨49-65
前言49-50

1. 材料50

1.1 材料与试剂50

1.2 主要仪器50

2. 策略50-54

2.1 壳聚糖微球的制备50-51

2.2 响应面浅析法的建立51-53

2.3 CMs 的形态学观察53

2.4 实验数据统计浅析53-54

3 结果与讨论54-63

3.1 通过 PBD 设计筛选影响 CMs 形成的影响因素54-55

3.2 最陡爬坡实验结果55

3.3 Box‐Behnken 实验结果55-58

3.4 响应面法优化实验条件58-62

3.5 CMs 表面形态观察62-63

4 结论63-65
第三章 壳聚糖微球及其乙酰化微球理化特性65-84
前言65-66

1. 材料66

1.1 材料与试剂66

1.2 主要仪器66

2. 策略66-69

2.0 壳聚糖微球及其乙酰化微球的制备66

2.1 微球的表面形态及粒径浅析66

2.2 壳聚糖及微球的红外光谱浅析66-67

2.3 壳聚糖及微球脱乙酰度的测定67

2.4 微球的溶胀率的测定67-68

2.5 微球的热稳定性测定68

2.6 微球的体外降解测定68

2.7 数据浅析68-69

3 结果与讨论69-83

3.1 微球的表面形态及粒径69-72

3.2 微球的红外光谱72-73

3.3 壳聚糖及微球的脱乙酰度73-76

3.4 微球的溶胀性76-79

3.5 微球的稳定性79-80

3.6 微球的体外降解80-83

4 结论83-84
第四章 壳聚糖微球及其乙酰化微球体外生物学特性84-99
前言84-85

1. 材料85

1.1 材料与试剂85

1.2 主要仪器85

2. 策略85论文导读：数据浅析893结果与讨论89-973.1微球对BSA的吸附性89-913.2微球的溶血率91-933.3微球的致血栓性93-943.4微球细胞毒性实验94-963.5MEFs细胞形态学观察96-974结论97-99第五章微球的生物安全性及兔耳栓塞探讨99-125前言99-1001.材料1001.1材料与试剂1001.2主要仪器1002.策略100-1092.1材料浸提液的制备100-101
-89

2.1 微球对 BSA 蛋白的吸附性测定85-86

2.2 微球血液相容测定86-87

2.3 微球细胞毒性测定87-89

2.4 数据浅析89

3 结果与讨论89-97

3.1 微球对 BSA 的吸附性89-91

3.2 微球的溶血率91-93

3.3 微球的致血栓性93-94

3.4 微球细胞毒性实验94-96

3.5 MEFs 细胞形态学观察96-97

4 结论97-99
第五章 微球的生物安全性及兔耳栓塞探讨99-125
前言99-100

1. 材料100

1.1 材料与试剂100

1.2 主要仪器100

2. 策略100-109

2.1 材料浸提液的制备100-101

2.2 皮肤迟发型超敏反应 (delayed-type hypersensitization)实验101-103

2.3 皮肤刺激性实验103-105

2.4 眼刺激实验105-106

2.5 小鼠全身急毒实验106-107

2.6 体内埋植实验107-108

2.7 动脉栓塞实验108

2.8 数据浅析108-109

3 结果与讨论109-124

3.1 皮肤迟发型超敏反应实验结果109-110

3.2 皮肤刺激性实验结果110-112

3.3 眼刺激实验结果112-113

3.4 小鼠全身急毒实验结果113-114

3.5 体内埋植实验结果114-121

3.6 兔耳栓塞实验结果121-124

4 结论124-125
第六章 阿霉素载药微球的制备及体外释放125-134
前言125

1. 材料125-126

1.1 材料与试剂125-126

1.2 主要仪器126

2. 策略126-127

2.1 盐酸阿霉素微球的制备126

2.2 盐酸阿霉素标准曲线的绘制126

2.3 盐酸阿霉素微球载药量和包封率126-127

2.4 盐酸阿霉素微球体外释放127

2.5 数据浅析127

3 结果与讨论127-132

3.1 盐酸阿霉素标准曲线的建立127-129

3.2 盐酸阿霉素微球包封率和载药量测定129

3.3 盐酸阿霉素微球体外释放的测定129-132

4 结论132-134
全文结论134-138
1 主要结论134-137
2 论新点137
3 有着的不足及展望137-138
参考文献138-152
附录152-153
致谢153-154
个人简历154
发表的学术论文154