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探讨腺苷酸抗氧化逆转IR-修复糖代谢失控作用及机制库

最后更新时间:2024-03-20 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:5502 浏览:13081
论文导读:类激素,具有抵抗胰岛素的作用,被称为抵抗素(Resistin)。抵抗素的血浆水平可被增加胰岛素敏感性的药物罗格列酮或其他噻唑烷二酮类显著抑制,被认为可能是由PPARγ直接调控其表达引起的。同时,有探讨指出腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)作为一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有改善IR的潜力,此外,AMP
摘要:探讨背景2型糖尿病(type2diabetes melptus,T2DM)是一种常见内分泌代谢紊乱性疾病,随着社会进步与人民生活的富裕,发病率逐年增高,已成为当今世界威胁人类健康和生命的重大公共卫生不足之一。目前,T2DM发病的两个关键因素被认为是胰岛素抵抗(Insupn resistance,IR)和胰岛β细胞功能减退,但至今仍未完全阐明T2DM的病因和发病机制。最近很多探讨和大量报道证明,人体肥胖的同时,伴有炎症信号相关通路和细胞氧化应激的激活,并提出了氧化应激学说、炎症病因学说等相关学说。但目前尚不清楚引发细胞应激的真正理由。初步探讨指出,氧化应激在其中占重要地位,其与IR和胰岛β细胞功能减退密切相关。虽然已经普遍认为,IR是T2DM的关键因素和环节,但氧化应激可能在IR发生中起着致因性作用;IR引起糖代谢紊乱早已成为“定论”,但氧化应激对糖代谢紊乱是否有着直接的相关性,尚不清楚。探讨进展表明,葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)在动员糖代谢通路中发挥“开关”的调控作用,而涉及糖代谢、决定血糖水平的来源主要有3条路:①有氧代谢的三羧酸循环“主路”,早已为人们熟知;②乏氧时的磷酸戊糖的酵解副路,是运动后血糖代谢的主要形式,是主路的有效补充,虽然不需要氧分子但合成能量的效价比较低;③饥饿、糖供应缺乏时的糖异生支路,糖异生历程中的关键酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPKC)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)。然而,在人们广泛关注氧化应激与IR损伤联系和代谢调控,却很少注意到氧化应激对糖来源和调控的影响,以及在血糖升高中“贡献”变化规律等分子机制。许多探讨表明,IR与糖异生有关,但是,到底是“IR导致糖异生,还是糖异生导致IR?”至今没有定论。而氧化应激与IR发生有关,但对于糖异生到底有无影响?他们三者的调控作用联系如何?至今未见报道。噻唑烷二酮类(thiazopdinediones, TZDs)是PPARγ高度选择性的激动剂是对胰岛素抵抗靶组织的有效药物。能通过激活PPARγ的基因上调表达,改善胰岛K+、Ca2+通道、推动胰岛素分泌增加,加速了脂肪代谢,因而具有逆转IR的作用。但是,还无法说明活化PPARγ如何改善胰岛素敏感性这个关键不足。近年来发现一种脂肪细胞来源的多肽类激素,具有抵抗胰岛素的作用,被称为抵抗素(Resistin)。抵抗素的血浆水平可被增加胰岛素敏感性的药物罗格列酮或其他噻唑烷二酮类显著抑制,被认为可能是由PPARγ直接调控其表达引起的。同时,有探讨指出腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有改善IR的潜力,此外,AMPK还参与了机体胰岛素敏感性的调节。实验目的通过建立新型高脂高糖加氧化剂tBHP致大鼠胰岛素抵抗大鼠动物模型,观察糖脂代谢和关键靶分子PPARγ、Resistin、AMPK等指标的变化,探讨胰岛素抵抗(IR)发生历程中,ROS与IR的调控联系;以及通过测定糖异生关键限速酶G6Pase、PEPCK等指标的变化,探讨ROS与IR相互作用历程中,是否有着糖异生的动员与调控,以及ROS对糖异生关键酶的作用机制。探讨糖尿病,特别是2型糖尿病,发生、进展历程中“氧化应激-胰岛素抵抗-糖代谢失控”的相互作用联系。为阐明:氧化应激是致因,IR是关键,糖代谢失控是推手的“致病链”的调控分子机制,试图通过有效的抗氧化作用在这三个环节上阻断“致病链”的进行,为寻找新的治疗及预防策略提供实验依据。通过建立新型高脂高糖加氧化剂tBHP致大鼠胰岛素抵抗大鼠动物模型,探讨胰岛素抵抗发生历程中ROS水平变化与及糖脂代谢的联系,基于氧化应激上ROS在改善IR历程中的关键作用及与糖异生的作用机制,为进一步认识PPARγ、Resistin、AMPK等IR相关分子在IR发生进展历程中的调控作用,以及阐明氧化应激-胰岛素抵抗-糖异生调控的初步机制,为寻找新的治疗及预防策略奠定基础。实验策略1. ROS诱导IR大鼠模型及相关调控机制的探讨。通过以下探讨,证明氧化应激是胰岛素抵抗产生的致因。①在高脂高糖饲料喂养的基础上,给大鼠注射小剂量tBHP,诱导大鼠产生IR。②测定实验动物血清、肝脏、脂肪组织的糖脂代谢及氧化应激相关指标,证明实验动物有着持续稳定论文导读:PPARγ的表达显著增高,高剂量时则显著降低。其对抵抗素表达的影响则相反,体现为低剂量时抑制,高剂量推动。同时我们利用PPARγ增敏剂RSG、AMPK抑制剂及Resistin中和抗体,发现通过RSG刺激PPARγ的活化及抵抗素中和抗体抑制抵抗素都显著提升了AMPK的磷酸化水平。我们还探讨了在100μMtBHP对胰岛素刺激下,增敏剂和抑制剂的干预
的氧化应激损伤并加重IR。③测定IR大鼠肝脏中抗氧化相关的调控酶谱如,PPARγ、SOD1、Gpx1、CAT、GCLC、GR mRNA水平和蛋白的表达变化。④肝脏组织病理学检查,观察ROS及高脂高糖刺激下肝脏的形态和结构变化。2. ROS对糖代谢相关因子和IR调控的分子机制探讨。在进一步探讨氧化应激调控作用的基础上,测定PPARγ、Resistin、AMPK等分子的相互作用特点及与IR发生的关联性,证明胰岛素抵抗是糖尿病发生的核心,由于胰岛素抵抗造成血糖升高,糖代谢失控可能是关键,阐明其调控机制。①体外实验采取人正常肝细胞系QZG作为实验对象,探讨不同浓度tBHP引起氧化应激对QZG细胞胰岛素信号影响的剂量效应联系。②在分离培养的细胞培养基中施加复合抗氧化剂,同时以TZDs为阳性对照组,观察氧化应激对细胞损伤的影响,以及抗氧化剂对细胞损伤的保护作用。③体内实验以建立的IR大鼠为探讨基础,通过TZDs为对照治疗药物,腹腔注射AMPK抑制剂、抵抗素中和抗体,测定氧化应激、糖代谢项指标的变化及肝组织在IR下的相关因子的蛋白表达变化。初步探讨PPARγ-Resistin-AMPK通路的相互联系以及脂代谢、脂毒性引起胰岛素抵抗的影响。④体外实验,利用western blot和RT-PCR等分子生物学技术,测定和观察tBHP对胰岛素刺激下Akt、AMPK磷酸化的变化,tBHP对胰岛素刺激下糖脂代谢相关因子蛋白表达的影响、不同增敏剂和抑制剂对葡萄糖+tBHP诱导IR的影响及对tBHP诱导IR中糖代谢及糖异生相关酶mRNA的影响。3.复合抗氧化剂阻断糖代谢失控及逆转IR的分子机制探讨。在初步证明糖尿病发生历程中氧化应激是致因,IR是关键,糖代谢失控是推手的“致病链”基础上,探讨抗氧化对这三个重要节点的抑制作用,以期证明抗氧化改善胰岛素抵抗的分子机制。①体外实验通过肝微粒体过氧化模型首先筛选合适剂量的复合抗氧化剂,以QZG细胞为探讨对象,观察经典降糖药及复合抗氧化剂对氧化应激诱导的肝细胞糖异生相关因子及胰岛素信号传导的影响、对氧化应激诱导IR的逆转作用的影响。②通过建立STZ诱导的糖尿病模型,观察经典降糖药及复合抗氧化剂对糖尿病大鼠降糖作用的比较,以及对STZ诱导糖尿病大鼠肝脏、胰腺损伤的保护作用。③通过给予实验动物模型经过筛选的有效抗氧化剂,观察抑制ROS、IR和糖代谢相关因子的作用效果,探讨其在糖尿病发生历程中的抗氧化治疗作用机制。实验结果1.通过给予大鼠高脂高糖饲料及tBHP注射一个月后,使其处于氧化应激状态,大鼠机体ROS生成增加,抗氧化能力减弱,脂质过氧化加重。与对照组相比,HGF组和HGF+tBHP组的体重变化显著、空腹血糖和空腹胰岛素水平显著升高、血清胆固醇、血清甘油三酯和血清游离脂肪酸含量显著增加,胰岛素敏感性降低。实验证明,高脂高糖饲料加tBHP能够快速稳定建立胰岛素抵抗模型,同时病理片中肝细胞受到的ROS氧化损伤提示,肝脏损伤在很大程度上影响了糖脂代谢,对于IR的产生和进展起到了推动作用。2.通过探讨不同剂量tBHP作用正常肝细胞QZG,我们发现,ROS显著影响胰岛素刺激下的Akt、AMPK的磷酸化,同时在低剂量的时候ROS推动Akt、AMPK的表达,而在高剂量时体现出显著的抑制作用。tBHP对胰岛素刺激下糖脂代谢相关因子的传导也产生了显著的影响作用,低剂量作用下IRS1、GLUT-4、PPARγ的表达显著增高,高剂量时则显著降低。其对抵抗素表达的影响则相反,体现为低剂量时抑制,高剂量推动。同时我们利用PPARγ增敏剂RSG、AMPK抑制剂及Resistin中和抗体,发现通过RSG刺激PPARγ的活化及抵抗素中和抗体抑制抵抗素都显著提升了AMPK的磷酸化水平。我们还探讨了在100μM tBHP对胰岛素刺激下,增敏剂和抑制剂的干预对糖代谢相关酶mRNA的表达。结果提示:tBHP显著提升了糖异生关键酶PEPCK、G6Pase的mRNA水平,却抑制了GLUT-4mRNA水平。RSG给药组和抵抗素抑制组显著转变了这一情况,GLUT-4mRNA水平显著升高。相反PEPCK、G6Pase的表达受到抑制。体内实验在实验一建模成功的基础上,观察了给予IR大鼠腹腔注射抵抗素中和抗体和AMPK抑制剂后,以RSG为阳性对照组,AMPK抑制剂组中,血清胰岛论文导读:且并不影响血糖的稳定。胰腺也有同样的结果,联合用药组更为显著的保护了胰腺损伤,改善了胰岛功能。结论:本课题通过建立高脂高糖联合低剂量氧化剂诱导IR大鼠模型,观察ROS在IR发生进展历程中的重要作用,探讨ROS刺激下的肝细胞中胰岛素相关信号通路PPARγ-Resisitin-AMPK间的相互调控联系,初步阐明了IR期间由于脂代谢紊乱,使PP
素水平显著升高,胰岛素敏感指数显著降低;抵抗素中和抗体组受到抑制,胰岛素敏感性得到改善。血清中胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸的水平在抵抗素抗体组也显著降低,而在AMPK抑制剂组显著升高。血清、肝脏组织的氧化损伤指标变化提示,氧化应激是导致IR不可缺少的因素,通过干预,抵抗素抗体组的氧化损伤显著减轻,这也提示糖脂代谢紊乱在很大程度上通过提升抗氧化酶的活性减轻氧化应激损伤而得到改善。3.通过与罗格列酮和二甲双胍单独给药比较,联合了复合抗氧化剂的这两种药物显著的降低了血糖,氧化应激水平也显著降低。同时我们惊奇的发现,联合了抗氧化剂的治疗组,血糖不但降低,与单独给药组相比,血糖的水平更为稳定和持久,而单独给药组血糖水平后期波动显著。体外实验提示,联合给药组体现出了比单独用药更能降糖的作用,同时其通过刺激上调肝脏PPARγ的表达,抑制了抵抗素水平,以而上调了AMPK的表达,抑制了糖异生相关酶的活性,改善了糖代谢,逆转了糖尿病的进展。肝脏胰腺的病理切片显示,罗格列酮虽然降糖的效果显著,但其有着一定的肝损伤副作用,二甲双胍的也有着一定的肝损伤。但是通过与复合抗氧化剂联用,不但改善了肝损伤,且并不影响血糖的稳定。胰腺也有同样的结果,联合用药组更为显著的保护了胰腺损伤,改善了胰岛功能。结论:本课题通过建立高脂高糖联合低剂量氧化剂诱导IR大鼠模型,观察ROS在IR发生进展历程中的重要作用,探讨ROS刺激下的肝细胞中胰岛素相关信号通路PPARγ-Resisitin-AMPK间的相互调控联系,初步阐明了IR期间由于脂代谢紊乱,使PPARγ表达下调,引起抵抗素水平的升高,导致AMPK活性受抑制,糖代谢异常,最终导致糖尿病。同时,我们发现长期用药期间,单纯糖尿病药物虽能起到很好的降糖作用,但是随着时间的推移,其降糖效果不断下降,且有着一定的肝脏及胰腺的损伤。而联合用药组非常成功的解决了这一难题,使血糖在相当长一段时间内保持稳定,且显著减轻了脏器的氧化损伤。通过实验我们推测,抗氧化剂的这一功效很可能是通过调控PPARγ-Resisitin-AMPK信号通路改善糖脂代谢,逆转IR来实现的。本探讨初步证明了糖尿病发生历程中有着氧化应激是致因,IR是关键,糖代谢失控是推手的“致病链”,抗氧化能够有效阻断这个“致病链”,为进一步探明T2DM的发生机制提供了初步实验依据,对于T2DM的预防和治疗也具有重要作用。关键词:胰岛素抵抗论文氧化应激论文2型糖尿病论文抵抗素论文腺苷酸活化蛋白激酶论文
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中文摘要10-17
Abstract17-25
前言25-28
文献回顾28-51

1. 糖尿病探讨概况28-30

2. IR的发生机制30-38

2.1 IR的概念及影响30

2.2 氧化应激与 IR30-32

2.3 FFA 与 IR32-34

2.4 PPARγ与 IR34-37

2.5 Resistin 与 IR37-38

3. 糖代谢调控通路的探讨进展38-44

3.1 糖代谢的调控“开关”-AMPK39-41

3.2 应激条件下糖异生的调控41-43

3.3 糖酵解与 IR43-44

4.IR 动物模型探讨进展44-46

4.1 链脲霉素(streptozotocin,STZ)腹腔或静脉注射44

4.2 地塞米松诱发的胰岛素抵抗模44-45

4.3 特殊膳食喂养 IR 大鼠模型45

4.4 高脂和高糖混合膳食喂养大鼠45-46

5.氧化应激的概念和分类46-47

5.1 氧化应激的概念46-47

5.2 氧化应激的种类47

6. 抗氧化剂与 IR47-51

6.1 抗氧化剂的概念与分类47-48

6.2 二甲双胍与 IR48-49

6.3 抗氧化剂复合链论述与 IR49-51

实验

一、ROS诱导IR大鼠模型及相关调控机制的探讨51-85

1 材料51-54

1.1 主要试剂51-53

1.2 主要仪器53-54

1.3 实验动物54

2 策略54-69

2.1 建立 SD 大鼠 IR 模型54-56

2.2 相关指标检测策略56-57

2.3 氧化剂对氧化损伤指标及 IR 相关指标的测定57-64

2.4 蛋白质定量浅析论文导读:的反应性107-1084.3AMPK在IR和糖代谢失控中的反应性108-1104.4PPARγ在IR和糖代谢失控中的反应性1104.5Resistin在IR和糖代谢失控中的反应性110-1114.6Akt在IR和糖代谢失控中的反应性111-112实验三复合抗氧化剂逆转IR及机制探讨112-1261材料1121.1主要试剂1121.2主要仪器1121.3实验动物1122策略112-1182.1微粒体
采取 Lowry’s 法64-65

2.5 RT-PCR检测基因 mRNA 水平的表达65-67

2.6 Western-blot测定蛋白表达67-68

2.7 组织病理学观察68-69

2.8 统计学处理69

3 结果69-81

3.1 大鼠体重变化69-70

3.2 空腹血糖变化70-71

3.3 胰岛素相关指标变化71-72

3.4 脂代谢相关指标变化72-74

3.5 氧化损伤指标变化74-78

3.6 AGEs 含量变化78-79

3.7 肝脏主要抗氧化酶及其相关因子 mRNA 表达79

3.8 肝脏抗氧化酶及糖代谢相关因子蛋白表达79-80

3.9 肝脏组织病理学80-81

4 讨论81-85

4.1 ROS 可以引起大鼠 IR81-83

4.2 高脂高糖环境生成 ROS 加速 IR 的发生83-84

4.3 ROS 能引起糖代谢酶和抗氧化酶表达异常84-85

实验

二、氧化应激对糖代谢调控的影响及 IR 发生的分子机制85-112

1 材料85-87

1.1 主要试剂85-86

1.2 主要仪器86

1.3 实验动物86

1.4 细胞系86-87

2 策略87-91

2.1 细胞培养87

2.2 不同剂量外源性H_2O_2对QZG细胞损伤剂量筛选87-88

2.3 细胞处理88-89

2.4 实验动物处理分组89

2.5 动物处死及标本采集89-90

2.6 糖脂代谢相关指标的检测90

2.7 氧化损伤指标及抗氧化指标的测定90

2.8 RT-PCR检测基因mRNA表达90-91

2.9 免疫印迹法(Western-blot)测定蛋白表达91

2.10 统计学处理91

3 结果91-107

3.1 tBHP的剂量对细胞活力的影响91-92

3.2 不同浓度梯度tBHP对培养24h后QZG细胞活性测定结果92-93

3.3 tBHP对胰岛素刺激下Akt、AMPK 磷酸化的影响93-94

3.4 tBHP对胰岛素刺激下糖脂代谢相关因子蛋白表达的影响94-95

3.5 不同增敏剂和抑制剂对葡萄糖+tBHP诱导IR的影响95-96

3.6 不同增敏剂和抑制剂对tBHP诱导IR中糖代谢及糖异生相关酶mRNA的影响96-97

3.7 体内实验糖代谢相关指标变化97-99

3.8 脂代谢相关指标变化99-101

3.9 氧化损伤指标变化101-106

3.10 肝组织IR相关因子蛋白表达变化106-107

4 讨论107-112

4.1 G6Pase在IR和糖代谢失控中的反应性107

4.2 PEPCK在IR和糖代谢失控中的反应性107-108

4.3 AMPK在IR和糖代谢失控中的反应性108-110

4.4 PPARγ在IR和糖代谢失控中的反应性110

4.5 Resistin在IR和糖代谢失控中的反应性110-111

4.6 Akt 在IR和糖代谢失控中的反应性111-112

实验

三、复合抗氧化剂逆转IR及机制探讨112-126

1 材料112

1.1 主要试剂112

1.2 主要仪器112

1.3 实验动物112

2 策略112-118

2.1 微粒体的制备112-113

2.2 微粒体VC/Fe~(2+)LPO激发模型的建立113-114

2.3 微粒体CHP LPO激发模型的建立114-115

2.4 微粒体CC14/NADP LPO激发模型的建立115-116

2.5 抑制率计算116

2.6 动物分组及处理116

2.7 动物处死及标本采集116-117

2.8 细胞培养及处理117

2.9 RT-PCR 检测基因 mRNA 表达117

2.10 免疫印迹法(Western-blot)测定蛋白表达117

2.11 组织病理学观察117

2.12 统计学处理117-118

3 结果118-124

3.1 肝微粒体过氧化模型对抗氧化剂的筛选与活性测定118-119

3.2 单体与复合药物的降糖作用比较119-120

3.3 单体与复合药物对肝糖异生及胰岛素信号相关因子的影响120-121

3.4 单体与复合药物对氧化应激诱导IR的逆转作用121-122

3.5 单体与复合药物对IR诱导的肝脏损伤的保护作用122-123

3.6 单体与复合药物对IR引起的胰腺损伤保护作用123-124

4 讨论124-126
小结126-130
参考文献130-142
个人简历和探讨成果142-144
致谢144