阐述癌细胞动物组织中微量糖链结构策略建立及运用

论文导读：
摘要：本论文以C57BL/6J小鼠肝脏、肾脏及心脏为探讨对象，运用多种现代提取分离与浅析技术，建立了一种系统浅析微量组织中神经节苷脂(gangposide, GLS)、N-糖链及糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAGs)的浅析策略，并将所建立的策略首次运用于人宫颈癌细胞(HeLa)中N-糖链和2型糖尿病小鼠(db/db)肾脏中GAGs组成及其精细结构差别性探讨。在此基础上，以所得内源性糖链和外源性海洋糖链为原料，利用糖生物芯片技术，首次探讨了GLS及海洋拟寡糖脂(NGLs)与甲型流感病毒(influenza A virus, H1N1)神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的结合作用，探讨和浅析了内源性GAGs和海洋酸性多糖与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)的结合特性。得出的主要结论如下：(1).利用高效薄层色谱(HPTLC)和电喷雾质谱(ESI-MS)联用技术，建立了一种可适用于不同组织中微量GLS组成的快速浅析策略。以C57BL/6J小鼠肝脏、肾脏和心脏组织为探讨对象，首次对其组织中GLS进行比较浅析。结果表明，不同组织来源的GLS的种类及组成有着较大差别。C57BL/6J小鼠肝脏中以GM1和GM2为主，心脏中主要含GM1、GM2和GT1a，而肾脏中5种GLS(GM3、GM2、GM1、GD1a和GT1a)含量差别不大。肝脏中GLS的种类和含量最多，与其作为脂类代谢的主要器官有关。(2).以C57BL/6J小鼠肾脏为探讨对象，建立了一种以同一组织中分步释放微量N-糖链和GAGs的策略。探讨表明，C57BL/6J小鼠肾脏中主要是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)。N-糖链轮廓浅析表明，小鼠肾脏有60种复杂多样的N-糖链，其中高甘露糖型所占比例较大，多数N-糖链含有乙酰神经氨酸(NeuAc)和岩藻糖(Fuc)。利用所建立的N-糖链浅析策略，首次全面浅析了HeLa细胞膜表面N-糖链的结构。在获得的34种N-糖链中，除有着高甘露糖型N-糖链，二天线、三天线、四天线和五天线等复杂型N-糖链外，还发现了与肿瘤发生和转移相关的平分型和Lewis糖链结构。(3).建立了一种适用于动物组织中微量GAGs精细结构浅析策略，并将其运用于2型糖尿病小鼠肾脏组织中GAGs的精细结构差别性浅析。采取2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone,2-AMAC)荧光标记柱前衍生高效液相色谱法，比较浅析了C57BL/6J正常组小鼠，db/db糖尿病模型组小鼠和海洋寡糖药物HS203给药组小鼠肾脏中GAGs的种类及二糖组成结构差别性。首次发现db/db糖尿病组小鼠肾脏中HS较正常组N-硫酸化程度降低，而海洋寡糖药物HS203可显著提升病变组肾脏中HS硫酸化程度，表明HS203具有治疗糖尿病肾病作用。(4).利用寡糖芯片技术，首次比较浅析了6种内源性GLS及36种海洋红藻来源拟寡糖脂与甲型流感病毒NA的特异性结合作用。结果表明，36种海洋来源的不同类型的卡拉胶寡糖及琼胶寡糖与NA蛋白的结合强度绝大多数都强于内源性GLS，且这种结合强度与寡糖硫酸根的有无、糖残基种类、连接方式及聚合度大小等相关。(5).利用多糖芯片技术，首次探讨了内源性GAGs和海洋酸性多糖与2型糖尿病肾病相关因子CTGF的结合作用，并发现硫酸化程度和糖醛酸含量是影响CTGF与硫酸乙酰肝素类多糖识别的关键因素。综上，通过动物组织中GLS、N-糖链及GAGs快速浅析策略的建立及该策略的成功运用，一方面可为糖组学探讨提供了可靠策略，有利于寻找新的疾病标志物，并为疾病的早期诊断治疗提供新的途径；另一方面，将有利于以GAGs细微结构的转变上评价药物的有效性，并有利于诠释糖链在相关疾病发生进展的生物学作用，并为以此开发相关糖类药物提供策略学基础。关键词：内源性糖链论文结构浅析策略论文宫颈癌细胞论文2型糖尿病论文神经氨酸酶论文
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Abstract7-16
前言16-44
1 糖脂的种类及生物学作论文导读：硫酸乙酰肝素222.5糖胺聚糖的生物学作用22-253糖蛋白N,O-糖链的结构分类及生物学作用25-273.1N-糖链253.2O-糖链253.3N,O-糖链的生物学作用25-273.3.1糖链对蛋白空间结构形成和稳定的影响263.3.2糖链在糖蛋白免疫反应中的作用263.3.3糖链对生殖的影响26-274糖链的结构浅析策略探讨进展27-31

4.1特殊糖苷酶酶解技术

用16-20

1.1 中性糖脂17

1.2 酸性糖脂17-18

1.3 鞘糖脂的生物学作用18-20

1.3.1 细胞粘附及识别功能19

1.3.2 信号转导功能19-20

1.3.3 肿瘤治疗20

2 糖胺聚糖的种类及生物学作用20-25

2.1 透明质酸21

2.2 硫酸角质素21

2.3 硫酸软骨素和硫酸皮肤素21-22

2.4 肝素和硫酸乙酰肝素22

2.5 糖胺聚糖的生物学作用22-25

3 糖蛋白 N,O-糖链的结构分类及生物学作用25-27

3.1 N-糖链25

3.2 O-糖链25

3.3 N,O-糖链的生物学作用25-27

3.1 糖链对蛋白空间结构形成和稳定的影响26

3.2 糖链在糖蛋白免疫反应中的作用26

3.3 糖链对生殖的影响26-27

4 糖链的结构浅析策略探讨进展27-31

4.1 特殊糖苷酶酶解技术27

4.2 糖链衍生化技术27-28

4.

2.1 还原胺化27-28

4.

2.2 化28

4.3 层析技术28-29

4.4 电泳技术29-30

4.5 核磁共振波谱技术30

4.6 质谱技术30

4.7 糖芯片技术30-31

5 不同结构糖链与相关疾病的联系31-34

5.1 神经节苷脂与流感病毒的联系31-32

5.2 糖胺聚糖与 2 型糖尿病的联系32-33

5.3 N,O-糖链与肿瘤的联系33-34

6 课题目的作用和整体思路34-36
参考文献36-44
第一章 动物组织中神经节苷脂结构浅析及与甲型流感病毒神经氨酸酶作用探讨44-67
1 引言44-45
2 实验部分45-49

2.1 材料与仪器45-47

2.

1.1 材料45-46

2.

1.2 仪器46-47

2.2 糖脂的提取47

2.3 糖脂的分离纯化47

2.3.1 Folch 分离法47

2.3.2 显色检测47

2.4 糖脂定量47-48

2.5 高效薄层色谱浅析48

2.6 质谱浅析48

2.7 糖脂与甲型流感病毒结合实验48-49

3 结果与讨论49-63

3.1 提取结果49-50

3.2 神经节苷脂含量结果50-51

3.3 分离纯化结果51-54

3.4 质谱浅析结果54-56

3.5 与甲型流感病毒结合实验结果56-63

4 小结63-64
参考文献64-67
第二章 动物组织中糖胺聚糖和 N-糖链分离纯化策略探讨67-83
1 引言67-68
2 实验部分68-71

2.1 材料与仪器68-69

2.

1.1 材料68

2.

1.2 仪器68-69

2.2 一步酶解法提取糖胺聚糖69

2.3 分步法提取糖胺聚糖和 N-糖链69-70

2.3.1 还原羧化69

2.3.2 两步酶解69

2.3.3 HLB 柱分离69-70

2.4 糖胺聚糖含量测定70

2.5 糖胺聚糖组成浅析70

2.5.1 聚丙烯酰胺电泳浅析70

2.5.2 醋酸纤维素薄膜电泳浅析70

2.6 N-糖链的释放与分离70-71

2.7 N-糖链全化衍生71

2.8 N-糖链质谱浅析71

3 结果与讨论71-81

3.1 糖胺聚糖提取策略比较71-72

3.

1.1 一步酶解法释放 GAGs71-72

3.

1.2 分步法提取 GAGs 和 N-糖链72

3.2 GAGs 含量测定结果72-73

3.3 GAGs 组成浅析73-74

3.4 N-糖链分离纯化结果74-75

3.5 N-糖链质谱浅析结果75-81

4 小结81-82
参考文献82-83
第三章 人宫颈癌细胞膜糖蛋白 N-糖链结构轮廓浅析83-95
1 引言83
2 实验部分83-85

2.1 材料与仪器83-84

2.2 实验历程84-85

2.1 细胞中总糖肽的提取84-85

2.2 糖肽中 N-糖链释放与分离85

2.3 N-糖链全化与纯化85

2.4 糖链质谱浅析85

3 结果与讨论85-92

3.1 HeLa 细胞 N-糖链释放、分离与纯化85-86

3.2 HeLa 细胞 N-糖链质谱浅析86-92

4 小结92-93
参考文献93-95
第四章 糖胺聚糖精细结构浅析策略探讨95-115
1 引言95
2 实验部分95-99

2.1 材料与仪器95-96

2.

1.1 材料95-96

2.

1.2 仪器96

2.2 肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ酶活比较96-97

2.3 软骨素酶酶活比较97-98

2.4 离子柱 (SAX) 高效液相浅析糖胺聚糖二糖组成98-99

2.5 荧光标记高效液相浅析糖胺聚糖二糖组成99

2.5.1 二糖荧光标记99

2.5.2 二糖液相浅析99

2.6论文导读：法制备糖胺聚糖AF488荧光标记物1182.6.2荧光标记多糖的纯化与标记率浅析1182.6.3多糖自动点样1182.6.4结合实验118-1193结果与讨论119-1423.1基本组成浅析119-1213.2二糖组成浅析结果121-1273.3与CTGF结合实验结果127-1423.3.1一步法制备糖胺聚糖AF标记物1273.3.2荧光标记多糖的纯化与标记率浅析127-1403.3.3
鲨鱼软骨来源软骨素 C 二糖组成浅析99
3 结果与讨论99-113

3.1 肝素酶酶活比较结果99-101

3.2 软骨素酶活测定结果101-105

3.3 离子柱高效液相浅析糖胺聚糖二糖组成结果105-107

3.4 荧光标记高效液相浅析糖胺聚糖二糖组成结果107-109

3.5 鲨鱼软骨来源软骨素二糖组成浅析109-113

4 小结113-114
参考文献114-115
第五章 糖尿病肾病小鼠肾脏糖胺聚糖结构差别性比较探讨115-145
1 引言115-116
2 实验部分116-119

2.1 材料与仪器116-117

2.

1.1 材料116

2.

1.2 仪器116-117

2.2 糖醛酸含量测定117

2.3 分子量分布117

2.4 糖胺聚糖组成浅析117-118

2.5 二糖浅析118

2.6 与 CTGF 结合实验118-119

2.6.1 一步法制备糖胺聚糖 AF488 荧光标记物118

2.6.2 荧光标记多糖的纯化与标记率浅析118

2.6.3 多糖自动点样118

2.6.4 结合实验118-119

3 结果与讨论119-142

3.1 基本组成浅析119-121

3.2 二糖组成浅析结果121-127

3.3 与 CTGF 结合实验结果127-142

3.1 一步法制备糖胺聚糖 AF 标记物127

3.2 荧光标记多糖的纯化与标记率浅析127-140

3.3 结合实验结果140-142

4 小结142-143
参考文献143-145
结论145-148
革新点148-149
发表文章149-152
参与课题152
获奖情况152-153
致谢153