浅论对虾对虾白斑综合症病毒性质和蛋白激酶wsv083设计

论文导读：一个WSSV病毒粒子中四种主要膜蛋白的数量48-492.8WSSV粒子和核衣壳比例的变化对OD值的影响49三、讨论49-54第三章细菌在克氏原螯虾感染WSSV后死亡历程中的作用54-741、前言54-572.材料与策略57-602.1材料57-582.2策略58-602.2.116SrDNAPCR产物的克隆和测序及种属的鉴定582.2.2WSSV的感染和纯化582.2.3注射
摘要：对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是一种杆状DNA病毒，具有囊膜和被膜，DNA为双链环状。WSSV是目前对虾的最主要的病害，对对虾养殖业造成了巨大危害。所以对WSSV的性质和感染机制等探讨对于对虾养殖业作用重大。本探讨的主要内容如下：①测定WSSV粒子的质量和其基本组成；②探讨微生物在感染了WSSV的螯虾死亡历程中所起的作用；③探讨了WSSV囊膜表面的蛋白的种类；④对WSSV的一个蛋白激酶wsv083进行了初步探讨。结果如下：1、通过先计算出WSSV基因组的质量，再测定WSSV的基因组DNA占整个WSSV粒子质量的比例的思路，计算出了一个完整WSSV粒子的质量。进一步测定得到WSSV悬液的每个OD600相当于3.34×108/l的病毒浓度。另外，WSSV各组分在总重量中的比例经测定如下：基因组DNA占10.17%，核衣壳中的蛋白占43.07%，囊膜中的脂类含量约为22%，囊膜中的蛋白质含量约为24.76%；另外还测定了四种主要膜蛋白的相比较例。2、为了探讨微生物在感染了WSSV的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的死亡历程中的作用，对染毒螯虾注射抗生素，发现其死亡率与对照组相比有显著下降。平板计数结果显示染毒螯虾的血淋巴中微生物数量有显著增加。浅析表明主要是嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、弗劳地柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonaaltophipa）和琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）等条件致病菌。而抗生素对WSSV的增殖没有显著影响。探讨结果表明螯虾在感染了WSSV后血细胞的消失导致体内病原微生物的数量大幅增加，以而加速了螯虾的死亡速度。3、利用生物素标记转移技术对牛血清白蛋白（BSA）和凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白进行标记，探讨其与对虾白斑综合症病毒（WSSV）之间的相互作用。发现分子量在50-56KD之间的两种蛋白质位于WSSV的表面，并且与鳃细胞膜蛋白具有特异性的相互作用。根据分子量推测可能是病毒的两种膜蛋白，VP52A和VP56。4、把wsv083在大肠杆菌中进行表达和纯化，与纯化的VP28和VP19置于激酶缓冲液中看能否催化磷酸化。探讨结果表明wsv083并不具备这个功能。另外还发现wsv083有着苏氨酸和酪氨酸的磷酸化，但没有丝氨酸的磷酸化。而wsv083的突变体则没有磷酸化。结果表明wsv083可以催化自身磷酸化。但其具体功能还需进一步探讨。关键词：对虾白斑综合症病毒论文生物素标记转移论文囊膜表面蛋白论文wsv083论文微生物论文
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Abstract10-12
第一章 前言12-39

一、 对虾白斑综合症病毒的发现及其命名12-14

二、 对虾白斑综合症病毒的大小和形态结构14-15

三、 WSSV 的主要宿主和主要的替代感染动物模型15-17

四、 WSSV 可能的侵染历程及其易感组织17-19

五、 WSSV 的分离纯化策略和检测技术19-21

六、 WSSV 的基因组学探讨21-27

七、 WSSV 的蛋白质组学探讨27-37

7.1 WSSV 的主要结构蛋白27-35

7.2 对虾白斑综合症病毒的非结构蛋白35-37

八、本探讨的选题依据及作用37-39
第二章 对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus）的一些基本性质的探讨39-54

一、 材料与策略39-43

1.1 材料39-40

1.2 策略40-43

1.2.1 病毒的感染和增殖40

1.2.2 完整病毒的纯化40-41

1.2.3 病毒膜蛋白和核衣壳蛋白的制备41

1.2.4 电镜观察 WSSV 粒子以及核衣壳41

1.2.5 WSSV 中膜蛋白和核衣壳比例的探讨41-42

1.2.6 WSSV 基因组 DNA 的提取42

1.2.7 WSSV 基因组 DNA 占其干重的比例探讨42-43

1.2.8 病毒溶液的 OD600与其浓度的换算联系探讨43

1.2.9 完整 WSSV 粒子和核衣壳不同比例下 OD 值的变化43

二、 计算历程和结果43-49

2.1 基因组 DNA 占 WSSV 干重的比例及 WSSV 干重43-44

2.2 病毒溶液的 OD600与其浓度的换算联系44-45

2.3 WSSV 中膜和核衣壳所占的比例45-46

2.4 膜蛋白中四种主要膜蛋白（VP28、VP26、VP2

4、VP19）的含量比例46-47

2.5 四种主要膜蛋白（VP28、VP26、VP2

4、VP19）的相比较例47-48

2.6 提取的 WSSV 和核衣壳的电子显微镜照片48

2.7 一个 WSSV 病毒粒子中四种主要膜蛋白的数量48-49

2.8 WSSV 粒子和核衣壳比例的变化对 OD 值的影响49

三、 讨论49-54

第三章 细菌在克氏原螯虾感染 WSSV 后死亡历程中的作用54-74

1、前言54-57

2.材料与策略57-60

2.1 材料57-58

2.2 策略58-60

2.1 16SrDNA PCR 产物的克隆和测序及种属的鉴定58

2.2 WSSV 的感染和纯化58

2.3 注射双抗58

2.4 虾血淋巴中 DNA 提取策略58-59

2.5 实时荧光定量 PCR59

2.6 螯虾血细胞的抽取与观察59

2.7 虾血淋巴中菌落种群变化的检测59-60

3.结果与浅析60-70

3.1 螯虾在注射 WSSV 后不同阶段血细胞观察60-61

3.2 感染 WSSV 后螯虾血细胞数量变化61-62

3.3 感染 WSSV 的螯虾注射抗生素对其死亡率的影响62-64

3.4 抗生素对于螯虾体内 WSSV 增殖的影响64

3.5 感染 WSSV 后的螯虾体内论文导读：NA测序结果119-122

5、主要仪器设备122-125致谢125上一页12

细菌种群及其数量变化探讨64-66

3.6 细菌的 16SrDNA 扩增结果66-70

4.讨论70-74

第四章 对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜表面蛋白的探讨74-81

一、 材料与策略75-77

1.1 材料75

1.2 策略75-77

1.2.1 WSSV 病毒粒子的感染和提取75

1.2.2 凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白组分的提取75-76

1.2.3 Sulfo-SBED 生物素标记程序76

1.2.4 生物素标记转移和检测76-77

二、 结果和浅析77-79

三、 讨论79-81

第五章 WSSV 的 wsv083 基因的探讨81-94

一、 材料与策略82-85

1.1 材料82

1.2 策略82-85

1.2.1 共转化程序82

1.2.2 虾腹足肌肉中 DNA 提取程序82-83

1.2.3 螯虾血淋巴 DNA 提取程序83

1.2.4 CIAP 对 wsv083 蛋白进行去除磷酸化处理83-84

1.2.5 激酶活性探讨84

1.2.6 Sulfo-SBED 生物素标记程序84

1.2.7 生物素标记转移和检测84-85

二、 结果85-91

2.1 wsv083 的扩增和重组质粒的双酶切鉴定85-86
2.2 wsv083 基因的表达与 Western blotting 检测86-87

2.3 wsv083 的激酶活性探讨87-91

三、 讨论91-94

第六章 本探讨的主要结论、革新点及探讨展望94-97

1、主要结论94-95

2、本探讨的主要革新点95

3、进一步探讨展望95-97

参考文献97-110
附录110-125

1、缩略词110-111

2、常用溶液及培养基的配制111-115

3、常规实验策略115-119

4、细菌的 16SrDNA 测序结果119-122

5、主要仪器设备122-125

致谢125