试议黄曲霉真菌毒素及潜藏性产毒真菌液相芯片多重测试策略

论文导读：
摘要：能够产生真菌毒素的真核细胞型微生物即为产毒真菌，真菌毒素是其产生的具有毒性的二级代谢产物。产毒真菌及其产生的毒素对农作物产品、食品及饲料的污染日趋严重，造成了危害与损失，其中，黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮及其产毒真菌不足比较突出，由此研发上面陈述的两类毒素和产毒真菌的快速检测新技术十分必要。液相芯片是美国Luminex公司开发出的将流式检测技术与芯片技术有机结合了的一种新技术，该技术具有高通量性、灵活性大、敏感性高、重复性好、检测速度快等优点。本论文针对目前在产毒真菌和真菌毒素检测领域里未见液相芯片技术的探讨报道的不足，开展了如下探讨。一、成功利用小分子真菌毒素OVA偶联物为免疫抗原，制备出了可以满足液相芯片检测实验的AFB1和ZEN多克隆抗体，具有一定的先进性。分别以人工合成抗原AFB1-OVA和ZEN-OVA为免疫原免疫新西兰大白兔，收集效价达标的抗血清；用改善的辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化，SDS聚丙烯凝胶电泳纯度鉴定，其抗体显示出泳带数减少但泳带更显著清晰。经测定，纯化的AFB1和ZEN多克隆抗体效价分别为1：32000和1：700；蛋白浓度分别为6.97mg/mL和6.42mg/mL；亲和常数分别为6.89×108L/mol和1.64×107L/mol；交叉反应试验证明：AFB1多克隆抗体分别与黄曲霉毒素B2、G1的交叉反应率为16.05%和6.66%；ZEN多克隆抗体与AFB1无交叉反应。二、首次将液相芯片技术引入真菌毒素检测领域，利用AFB1多克隆抗体和单克隆抗体、ZEN多克隆抗体和单克隆抗体，通过对近万个实验样本的浅析测试，优化得到了AFB1、ZEN液相芯片反应系统，建立了AFB1、ZEN免疫液相芯片单重、二重测试策略，填补了液相芯片在真菌毒素探讨领域的空白。1．探讨确定了AFB1液相芯片最佳反应系统为：偶联抗原AFB1-BSA为100μg，AFB1与抗体孵育时间为24h，AFB1单抗和多抗的临界饱和浓度分别为0.75μg/mL和6.0μg/mL；ZEN液相芯片最佳反应系统为：偶联抗原ZEN-BSA为100μg，ZEN与抗体孵育时间为15h，ZEN单抗和多抗的临界饱和浓度分别为2.0μg/mL和10.0μg/mL。2．1采取AFB1单克隆抗体，14号微球所建立的AFB1检测标准曲线R2为0.9734，IC50为2.33ng/mL，最低检测量为0.1165ng，线性范围为0.06-11.25ng/mL；采取AFB1单克隆抗体，28号微球所建立的AFB1检测标准曲线R2为0.9762，IC50为3.00ng/mL，最低检测量为0.1500ng，线性范围为0.03-11.25ng/mL；两种微球之间无显著性差别。2．2采取AFB1多克隆抗体，14号微球所建立的AFB1检测标准曲线R2为0.9842，IC50为1.33ng/mL，最低检测量为0.0665ng，线性范围为0.03-11.25ng/mL；采取AFB1多克隆抗体，28号微球所建立的AFB1检测标准曲线R2为0.9906，IC50为1.43ng/mL，最低检测量为0.0715ng，线性范围为0.03-11.25ng/mL；两种微球之间无显著性差别。3．1采取ZEN单克隆抗体，36号微球所建立的ZEN检测标准曲线R2为0.9936，IC50为1.3846ng/mL，最低检测量为0.0692ng，线性范围为0.05-10.0ng/mL；3．2采取ZEN多克隆抗体，36号微球所建立的ZEN检测标准曲线R2为0.9988，IC50为3.2500ng/mL，最低检测量为0.1625ng，线性范围为0.05-10.0ng/mL。4．采取AFB1多克隆抗体、ZEN单克隆抗体，28号和36号微球建立AFB1、ZEN二重定量检测策略，其中检测AFB1标准曲线R2为0.9842，IC50为2.3333ng/mL，最低检测量为0.0583ng，线性范围为0.06-4.80ng/mL；检测ZEN标准曲线R2为0.997，IC50为3.2000ng/mL，最低检测量为0.0800ng，线性范围为0.10-10.0ng/mL。5．以脱脂牛奶和全脂牛奶为实验样本，选择AFB1多克隆抗体反应系统，进行AFB1添加回收试验，结果显示：所有样本回收率均大于75%，变异系数均小于5%。6．以脱脂牛奶和全脂牛奶为实验样本，选择ZEN单克隆抗体反应系统，进行ZEN添加回收试验，结果显示：所有样本回收率均大于75%，变异系数均小于5%。7．以脱脂牛奶和全脂牛奶为实验样本，选择AFB1、ZEN液相芯片二重定量检测反应系统，同时进行AFB1、ZEN添加回收试验，结果显示：所有样本回收率均大于75%，变异系数均小于5%。三、研制建立了潜藏性产黄曲霉毒素产毒真菌和产玉米赤霉烯酮产毒真菌液相芯片多重检测策略，其灵敏度比传统策略提升了5-500倍，并首次实现了同时检测两种产毒真菌的目标理想，填补了该领域的探讨空白。1．通过NCBI进行DNA序列比对和浅析，分别针对产黄曲霉毒素产毒真菌产毒制约基因nor-1、ver-1、omtA，产玉米赤霉烯酮产毒真菌产毒制约基因PKS4、ZEB2和真菌ITS基因片段的保守区域，利用Primer Premier5.0软件设计、在线序列比对工具多重序列比对，得到了序列特异性好、交叉反应率很小的6种探针引物。并以黄曲霉（AS3.4408）菌株DNA和禾谷镰刀菌（AS3.4598）菌株DNA为摸板，采取单重PCR技术，进行扩增验证。2．回收nor-1、ver-1、omtA、PKS4、ZEB2和ITS6个目的片段，进行克隆构建、阳性克隆子测序。测序结果显示该nor-1基因片段与Genbank中黄曲霉nor-1和寄生曲霉nor-1的同源性分别达100%和98%；ver-1基因片段与黄曲霉ver-1和寄生曲霉ver-1的同源性分别达100%和97%；omtA基因片段与黄曲霉omtA和寄生曲霉omtA的同源性分别达100%和94%。PKS4和ZEB2的基因片段分别与Genban论文导读：液相芯片多重检测策略。结果表明：用该策略检测产黄曲霉毒素的黄曲霉、寄生曲霉，产玉米赤霉烯酮的禾谷镰刀菌的检测结果为阳性；检测不产上面陈述的两种真菌毒素的构巢曲霉、土曲霉、烟曲霉、黑曲霉的检测结果为阴性，表明所建立策略特异性好。采取阳性克隆子质粒DNA评价该策略的灵敏性，实验结果表明：该策略可对nor-1、ver-1、o
k中禾谷镰刀菌PKS4和ZEB2的同源性均达100%。ITS片段与黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉等序列同源性达100%。以上均证实所设计的引物特异性好。3．根据液相芯片检测策略原理，对下游引物进行生物素修饰，以使PCR扩增产物生物素化；对探针进行氨基化修饰，以便于探针与羧基化微球偶联；合成与核酸探针完全互补的偶联质控序列，并对其5’端进行生物素标记，以有效报告核酸探针与荧光编码微球偶联结果。4．采取自主设计的特异性探针与引物，建立多重PCR反应系统，建立了潜藏性产黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮产毒真菌液相芯片多重检测策略。结果表明：用该策略检测产黄曲霉毒素的黄曲霉、寄生曲霉，产玉米赤霉烯酮的禾谷镰刀菌的检测结果为阳性；检测不产上面陈述的两种真菌毒素的构巢曲霉、土曲霉、烟曲霉、黑曲霉的检测结果为阴性，表明所建立策略特异性好。采取阳性克隆子质粒DNA评价该策略的灵敏性，实验结果表明：该策略可对nor-1、ver-1、omtA、PKS4、ZEB2、ITS基因进行1重、2重、3重、4重、5重、6重检测，其检测灵敏度分别为：0.20ng/μL、2.00pg/μL、0.20ng/μL、0.02ng/μL、2.00pg/μL、2.00pg/μL。关键词：液相芯片论文黄曲霉毒素论文玉米赤霉烯酮论文抗体论文产毒真菌论文PCR论文
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ABSTRACT21-25
第一章 文献综述25-49

1.1 真菌毒素的危害及致病机理25-27

1.1 真菌毒素的危害25-26

1.2 真菌毒素对农作物的污染特点26

1.3 真菌毒素的致病机理26-27

1.2 几种重要的真菌毒素27-31

1.2.1 黄曲霉毒素（Aflatoxin）27-28

1.2.2 赭曲霉毒素（Ochratoxin）28

1.2.3 玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）28-29

1.2.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivaenol DON）29

1.2.5 T-2 毒素（T-2 toxins）29

1.2.6 伏马菌素（Fumonisin）29-30

1.2.7 麦角生物碱(Ergot Alkaloids)30

1.2.8 桔霉素（Citrinin，CIT）30-31

1.2.9 展靑霉素（Patupn）31

1.2.10 杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin)31

1.3 真菌毒素的检测策略31-39

1.3.1 生物学检测策略32

1.3.2 物理化学检测策略32-34

1.3.3 免疫学检测策略34-37

1.3.4 液相芯片技术37-39

1.4 真菌毒素的检测历程及限量浅析39-41

1.4.1 真菌毒素的检测历程39-40

1.4.2 国际上真菌毒素限量近况浅析40-41

1.5 常见产毒真菌的发生与分布41-43

1.5.1 黄曲霉毒素产生菌的发生及分布41-42

1.5.2 玉米赤霉烯酮产生菌的发生及分布42-43

1.6 常见产毒真菌产毒制约基因探讨43-46

1.6.1 黄曲霉产生菌的检测43-45

1.6.2 玉米赤霉烯酮产生菌的检测45-46

1.7 多重 PCR 技术介绍46-47

1.7.1 多重 PCR 技术的概念46

1.7.2 多重 PCR 技术的运用46-47

1.8 本探讨的目的作用及主要探讨内容47-49

1.8.1 本探讨的目的作用47-48

1.8.2 主要探讨内容48-49

第二章 黄曲霉毒素 B1 多克隆抗体的制备及性质鉴定49-65

2.1 材料与策略49-58

2.

1.1 试验材料和仪器49-52

2.

1.2 试验策略52-58

2.2 结果与浅析58-63

2.1 抗血清效价的测定58-60

2.2 抗血清的纯化60-62

2.3 抗血清的特异性测定62-63

2.3 结论与讨论63-65

2.3.1 结论63

2.3.2 讨论63-65

第三章 玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及性质鉴定65-76

3.1 材料与策略65-69

3.

1.1 试验材料和仪器65-66

3.

1.2 试验策略66-69

3.2 结果与浅析69-74
3.

2.1 抗血清效价的测定69-71

3.

2.2 抗血清的纯化71-72

3.

2.3 抗血清的特异性测定72-74

3.3 结论与讨论74-76

3.1 结论74

3.2 讨论74-76

第四章 AFB1 液相芯片定量检测策略的建立、评价与运用76-102

4.1 材料与策略76-83

4.

1.1 主要仪器与设备76

4.

1.2 主要供试试剂76-77

4.

1.3 试剂配置77

4.

1.4 微球的活化与偶联77-79

4.

1.5 抗体的生物素标记及性质鉴定79-81

4.

1.6 AFB1 液相芯片检测策略的建立81-82

4.

1.7 AFB1 液相芯片定量检测策略的运用及评价82-83

4.

1.8 数据浅析83

4.2 结果与浅析83-99
4.

2.1 微球的活化与偶联83-84

4.

2.2 抗体的生物素标记及性质鉴定84-85

4.

2.3 AFB1 液相芯片检测反应系统优化85-91

4.

2.4 AFB1 抗体临界饱和浓度测定91-93

4.

2.5 AFB1 液相芯片定量检测策略的建立93-95

4.

2.6 AFB1 液相芯片定量检测策略特异性检测95-99

4.

2.7 AFB1 牛奶样品添加回收试验99

4.3 结论与讨论99-102
4.

3.1 结论99-100

4.

3.2 讨论100-102

第五章 ZEN 液相芯片定量检测策略的建立、评价与运用102-117

5.1 材料与策略102-106

5.

1.1 主要仪器与设备102

5.

1.2 主要供试试剂102

5.

1.3 试剂配置102-103

5.

1.4 微球的活化与偶联103

5.

1.5 抗体的生物素标记及性质鉴定103-104

5.

1.6 ZEN 液相芯片检测策略的建立104-105

5.1.7 ZEN 液相芯片定量检测策论文导读：1.7核酸探针与荧光编码微球偶联126-1287.1.8潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的建立128-1307.1.9潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的评价1307.2结果与浅析130-1437.2.1菌株DNA的提取和纯化130-1317.2.2引物和探针特异性验证131-1337.2.3探针与微球的偶联133-1347.2.4潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的建立134-1407.2
略的运用及评价105-106

5.

1.8 数据浅析106

2 结果与浅析106-115 5.

2.1 微球的活化与偶联106-107

5.

2.2 抗体的生物素标记及性质鉴定107-108

5.

2.3 ZEN 液相芯片检测反应系统优化108-110

5.

2.4 ZEN 抗体临界饱和浓度测定110-112

5.

2.5 ZEN 液相芯片定量检测策略的建立112-113

5.

2.6 ZEN 液相芯片定量检测策略特异性检测113-115

5.

2.7 ZEN 牛奶样品添加回收试验115

5.3 结论与讨论115-117
5.

3.1 结论115-116

5.

3.2 讨论116-117

第六章 AFB

1、ZEN 液相芯片二重定量检测策略的建立与运用117-123

6.1 材料与策略117-119

6.

1.1 主要仪器与设备117

6.

1.2 主要供试试剂117

6.

1.3 试剂配置117

6.1.4 AFB

1、ZEN 液相芯片二重定量检测策略的建立117-118

6.1.5 AFB

1、ZEN 液相芯片二重定量检测策略的运用118-119

6.1.6 数据浅析119

6.2 结果与浅析119-121

6.2.1 AFB

1、ZEN 液相芯片二重定量检测策略的建立119-120

6.2.2 AFB

1、ZEN 牛奶加标回收检测120-121

6.3 结论与讨论121-123
6.

3.1 结论121

6.

3.2 讨论121-123

第七章 潜藏性产黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮产毒真菌液相芯片多重检测策略的建立123-146

7.1 材料与策略123-130

7.

1.1 主要供试菌株123-124

7.

1.2 主要供试试剂124

7.

1.3 主要仪器与设备124

7.

1.4 菌株 DNA 的提取和纯化124

7.

1.5 引物与探针设计124-126

7.

1.6 引物特异性验证126

7.

1.7 核酸探针与荧光编码微球偶联126-128

7.

1.8 潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的建立128-130

7.

1.9 潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的评价130

7.2 结果与浅析130-143
7.

2.1 菌株 DNA 的提取和纯化130-131

7.

2.2 引物和探针特异性验证131-133

7.

2.3 探针与微球的偶联133-134

7.

2.4 潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的建立134-140

7.

2.5 潜藏性产毒真菌液相芯片检测策略的评价和运用140-143

7.3 结论与讨论143-146
7.

3.1 结论143

7.

3.2 讨论143-146

第八章 总结与展望146-148
参考文献148-163
攻读博士学位论文期间发表文章及申请专利163-164
附录164-168
学位论文图表统计168-169
致谢169-170