探讨细胞株草苁蓉对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡影响及其分子机制

论文导读：
摘要：肝纤维化是各种慢性肝病导致肝硬化的共同病理基础和必经之路,是对慢性损伤的修复反应。肝纤维化以细胞外基质的大量产生特别是Ⅰ型胶原的异常沉积为主要特点。其中肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是细胞外基质的主要来源,在正常肝脏组织中数目很少,为肝内胶原合成的主要细胞,它在肝纤维化发生进展历程中起着至关重要的作用。HSC的激活和增殖推动肝纤维化,抑制HSC的增殖、诱导其凋亡可减轻甚至逆转肝纤维化。所以近年来,抑制肝星状细胞的增殖以及诱导其凋亡已经成为探讨、治疗肝纤维化的重点课题。而肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活、增殖和凋亡机制非常复杂,涉及许多细胞因子、调节蛋白、及各种信号通路,HSC的激活和增殖涉及的主要的细胞因子主要有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、胰岛素生长因子(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)以及血小板源性生长因子又称血小板衍化生长因子(PDGF)等,调节HSC凋亡的主要有Bcl-2家族、caspase家族等通过各种凋亡信号途径引起细胞凋亡。PDGF是目前已知的最强的促HSC增殖因子,而活化的HSC分泌大量的PDGF,通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,下调p27的表达而推动HSC进入S期,使HSC持续活化和增殖,导致HSC显著增殖。在肝纤维化的历程中,PDGF可通过系列信号传导激活Akt/p70S6k信号通路,通过阻断Akt/p70S6k信号通路可达到抑制HSC的增殖、推动其凋亡并减少Ⅰ型胶原的表达的效果。草苁蓉为长白山区特有的天然要用植物,具有抗自由基、抗脂质过氧化、抗肿瘤、抗炎等作用,先期探讨已证实,草苁蓉乙醇提取物有抗肝纤维化的作用。朴虎林等通过探讨已经证明草苁蓉乙醇提取物可较好的防治四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化。2005年世界华人消化杂志发表朴熙绪等关于草苁蓉乙醇提取物对二亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的治疗作用的论文,通过采血及取肝组织检测各项指标,结果草苁蓉组与模型组相比肝纤维化的程度减轻,而且发现在肝组织中α平滑肌肌动蛋白(a-A)表达下降,实验表明草苁蓉可能通过抑制肝星状细胞的激活和抗脂质过氧化物作用来防治大鼠肝纤维化的发生。吴春松等通过猪血清诱导大鼠发生肝纤维化制造模型,实验探讨发现草苁蓉可以使PCⅡ、CⅣ的作用降低,并论文导读：HE染色、AO/EB荧光染色、TUNEL染色、以及透射和扫描电镜观察发现草苁蓉乙醇提取物作用于HSC-T6细胞后出现典型的细胞凋亡形态学变化：细胞表面的微绒毛消失,体积变小,胞质浓缩,核染色质边集、细胞核固缩、并出现核碎裂、出泡等现象。③流式细胞仪检测：经草苁蓉乙醇提取物处理后大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的细胞周期被阻滞于G0/G1
能抑制转化生长因子及α-平滑肌肌动蛋白的表达。并且经过病理组织学检查,草苁蓉能够显著改善模型中大鼠的肝脏纤维化。并且具有抑制大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成作用。目的：本实验以大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为实验对象,探讨草苁蓉乙醇提取物对其生长抑制及诱导凋亡的影响。在此基础上,进一步探讨了凋亡调节蛋白、Akt/p70S6k信号通路对HSC增殖和凋亡的调节机制及Ⅰ胶原表达的影响。为草苁蓉成为防治肝纤维化的有效天然药物提供有利依据。策略：本实验选用大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为实验对象进行体外培养,用MTT比色法测定不同浓度、不同时间段草苁蓉乙醇提取物对HSC-T6的抗增殖作用；运用倒置显微镜、HE染色光学显微镜、吖啶橙/溴化乙锭双染色荧光显微镜及扫描电镜技术观察药物作用后的细胞形态学转变；运用流式细胞仪(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)检测细胞周期及细胞凋亡率的变化。运用RT-PCR法检测Ⅰ型胶原α1(I) mRNA的表达,观察胶原合成的变化。Western Blotting法检测凋亡调节蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9; Akt/p70S6k信号通路中总的Akt和p70S6k及磷酸化的Akt和p70S6k；Ⅰ型胶原蛋白,用于观察凋亡调节蛋白和信号通路对肝星状细胞的抑制增殖和诱导凋亡的调节机制。结果：①MTT实验表明：草苁蓉乙醇提取物能有效抑制HSC-T6细胞增殖,并呈现出浓度以及时间的依赖性联系。②形态学变化：通过HE染色、AO/EB荧光染色、TUNEL染色、以及透射和扫描电镜观察发现草苁蓉乙醇提取物作用于HSC-T6细胞后出现典型的细胞凋亡形态学变化：细胞表面的微绒毛消失,体积变小,胞质浓缩,核染色质边集、细胞核固缩、并出现核碎裂、出泡等现象。③流式细胞仪检测：经草苁蓉乙醇提取物处理后大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的细胞周期被阻滞于G0/G1期,并且与对照组相比凋亡率显著上升,有统计学差别,凋亡率随药物浓度的升高而呈增高走势。④Western Blotting法测定Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表明：草苁蓉乙醇提取物显著上调促凋亡蛋白,Bax显著增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2则显著降低,且两者都体现剂量依赖性,导致Bax/Bcl-2比值上升。草苁蓉还显论文导读：g法测定Ⅰ胶原表达显示：草苁蓉乙醇提取物能显著抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)mRNA的表达和下调Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论：①草苁蓉乙醇提取物在体外可显著抑制HSC-T6的增殖。②草苁蓉乙醇提取物在体外可诱导大鼠肝星状细胞(HSC-T6)凋亡,并使细胞周期阻滞于G0/G1期。③草苁蓉乙醇提取物显著上调活化的caspase-3和caspase-9;下调Bcl-2/B
著增加活化的caspase-3和活化的caspase-9蛋白水平。⑤Western Blotting法检测测定Akt和p70S6表明：草苁蓉乙醇提取物显著能抑制磷酸化的Akt和p70S6k水平,而总的Akt和p70S6k水平无转变,表明Akt/p70S6k信号通路受到抑制。⑥Real-timePCR和Western Blotting法测定Ⅰ胶原表达显示：草苁蓉乙醇提取物能显著抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)mRNA的表达和下调Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论：①草苁蓉乙醇提取物在体外可显著抑制HSC-T6的增殖。②草苁蓉乙醇提取物在体外可诱导大鼠肝星状细胞(HSC-T6)凋亡,并使细胞周期阻滞于G0/G1期。③草苁蓉乙醇提取物显著上调活化的caspase-3和caspase-9;下调Bcl-2/Bax比率。④草苁蓉乙醇提取物显著抑制PDGF激活的Akt/p70S6k信号通路。⑤草苁蓉乙醇提取物能显著抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型胶原蛋白的表达。关键词：草苁蓉乙醇提取物论文大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)论文细胞增殖论文细胞凋亡论文Akt/p70~(S6k)信号通路论文
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Abstract8-13
英文缩略词13-14
第一章 前言14-16
第二章 实验材料与策略16-27

2.1 主要材料与试剂16-19

2.

1.1 细胞株16

2.

1.2 药物与试剂16

2.

1.3 仪器16-17

2.

1.4 RT-PCR测定17-18

2.

1.5 免疫蛋白质印迹(Western blot)测定18-19

2.2 实验策略19-25

2.1 细胞培养与传代19

2.2 细胞分组及药物处理19-20

2.3 倒置显微镜形态学观察20

2.4 微量细胞培养四氮唑蓝实验法(MTT法)20-21

2.5 HE常规染色光学显微镜观察21

2.6 AO/EB双染色荧光显微镜观察21

2.7 扫描电镜细胞超微结构观察21

2.8 流式细胞仪检测21-22

2.9 RT-PCR测定collagen α 1 mRNA的表达22-24

2.2.10 免疫蛋白质印迹(Western blot)2论文导读：-343.1MTT比色法检测对HSC-T6增殖的影响,27-293.2草苁蓉对HSC-T6细胞的形态学影响293.2.1倒置显微镜形态学观察293.2.2HE染色光学显微镜形态学观察293.2.3AO/EB双染色荧光显微镜观察293.2.4扫描电镜超微结构观察293.3流式细胞仪检测结果检测29-303.3.1细胞凋亡结果303.430-343.4.1凋亡调节蛋白Bcl-

2、Bax、caspade-

4-25

2.3 数据的统计学处理检测25-27

第三章 结果27-34

3.1 MTT比色法检测对HSC-T6增殖的影响,27-29

3.2 草苁蓉对HSC-T6细胞的形态学影响29

3.

2.1 倒置显微镜形态学观察29

3.

2.2 HE染色光学显微镜形态学观察29

3.

2.3 AO/EB双染色荧光显微镜观察29

3.

2.4 扫描电镜超微结构观察29

3.3 流式细胞仪检测结果检测29-30

3.1 细胞凋亡结果30

3.430-34

3.4.1 凋亡调节蛋白Bcl-

2、Bax、caspade-3和caspase-9检测结果30-31

3.4.2 Akt/p70S6k测定结果31-32

3.

4.3 Ⅰ型胶原的表达32-34

附图34-41 讨论41-49
结论49-50
参考文献50-56
综述56-77
参考文献69-77
致谢77-78
探讨生期间已发表论文78