浅议红细胞rHuEPO对高糖环境系膜细胞作用和血透患者rHuEPO抵抗与Hepcidin联系

论文导读：达,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,作用于高糖培养的MCs,细胞MCP-1、TGF-β1mRNA的表达均显著降低。3、各组系膜细胞的凋亡情况对照组系膜细胞有一定的凋亡率,高糖组系膜细胞早期凋亡和晚期凋亡显著增加,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,作用于高糖培养的MCs,可抑制高糖培养系膜细胞的凋亡。

4、系膜细胞Bcl-2和Caspase-3的表达

摘要：探讨背景和目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)患者死亡的主要理由。目前糖尿病肾病的治疗原则主要是制约血糖、血压,制约饮食和改善肾功能,但临床上糖尿病肾病患者一旦进入临床蛋白尿期,尽管基于各种手段,DN患者的肾功能还是会逐渐减退,逐渐进展至ESRD,由此带来的透析、肾移植等治疗费用在整个医疗支出中所占比例正逐年增加,给病人和社会造成极大的经济负担。目前关于DN发病机制的探讨既往多集中在血糖、血脂代谢紊乱与血流动力学异常等方面。近年探讨发现炎症反应参与DN的发生和进展。肾小球系膜细胞(MCs)和系膜基质增加是糖尿病肾小球硬化的主要病变,MCs分泌细胞因子和细胞外基质,参与肾小球炎症反应历程,推动肾小球硬化,由此探讨药物对炎症状态下肾小球MCs增殖和分泌,在糖尿病肾病的治疗中具有十分重要的作用。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)主要是由成人肾脏产生的一种糖蛋白激素,能特异性地作用于哺乳动物的红系祖细胞,推动其增殖、分化并抑制其凋亡。自人工合成以来一直用于治疗各种疾病导致的贫血,特别是肾性贫血的治疗。EPO通过与EPO受体(EPOR)结合启动细胞内信号转导通路起作用。近年来,EPO的细胞保护作用和器官保护作用备受关注,EPOR不仅有着于红系生成细胞,还有着于全身各组织器官。重组人红细胞生成素(rHuEPO)被认为是一种全身性的、心管系统和肢体保护性细胞因子。其中rHuEPO对神经系统和心血管系统探讨较多,临床上已用于神经系统、心血管系统和肢体缺血性疾病的治疗,在肾脏保护方面,目前对急性肾损伤的保护作用机制探讨较为透彻的有抗氧化应激、抗凋亡、抗炎症反应。关于EPO在糖尿病肾病的保护作用,探讨较少,最近国内外有文献报道EPO对糖尿病肾病动物模型的保护作用。关于EPO对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞的作用目前未见有报道,肾脏是EPO的主要产生部位,且EPO及受体在肾缺血再灌注损伤及毒性物质损伤时表达上调,文献证实EPO受体有着肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞,表明EPO具有内源性肾脏保护作用。本实验通过体外系膜细胞培养技术,给予高糖环境下,rHuEPO刺激,用流式细胞技术、实时荧光定量PCR及Western bolt等分子生物学技术,观察系膜细胞的形态、细胞增殖和凋亡,检测细胞凋亡相关基因Bcl-2(B-Cell Lymphoma)、caspase-3蛋白的表达,探讨rHuEPO对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响并浅析可能的机制。材料与策略1、体外培养肾小球系膜细胞,分别培养于正常和高糖葡萄糖浓度环境中,采取CCK-8比色法观察24、48、72小时MCs增殖的情况。选择高糖组浓度为30mmol/L,系膜细胞分组为：空白对照组(NC)、高糖组(HG),高糖和不同浓度的rHuEPO (1、10、50、100、1000IU/ml)干预组,作用24、48、72小时。CCK-8比色法检测细胞增殖能力,观察不同浓度、不同时间rHuEPO对高糖培养的系膜细胞增殖的影响；倒置显微镜动态观察系膜细胞形态和增殖的变化。2、运用ELISA法和实时荧光定量PCR策略检测细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、转化生长因子-β1(tranorming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白和mRNA的表达。3、运用流式细胞仪(FCM)检测rHuEPO对高糖培养的系膜细胞凋亡的影响。4、Western bolt检测caspase-3和Bcl-2蛋白的表达情况。结果1、不同浓度葡萄糖、rHuEPO对系膜细胞增殖的影响在30mmol/L以下时,不同浓度的葡萄糖培养系膜细胞24、48、72小时发现,葡萄糖对系膜细胞的增殖呈浓度和时间依赖性,以30mmol/L培养72小时反应最佳,40mmol/L和50mmol/L的葡萄糖有抑制系膜增殖的效应。选择高糖组葡萄糖浓度为30mmol/L,分别加入不同的rHuEPO浓度,rHuEPO在低于100IU/ml能推动高糖诱导的MCs增生,呈剂量和时间依赖性,rHuEPO在1000IU/ml时,细胞毒性显著,大部分细胞死亡2. ELISA法检测细胞培养上清MCP-1、TGF-β1含量,real time FQ-PCR策略检测细胞MCP-1、TGF-β1mRNA的表达正常培养的系膜细胞MCP-1、TGF-βmRNA有低水平的表达,高糖组刺激24、48、72小时均有高水平的表达,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,作用于高糖培养的MCs,细胞MCP-1、TGF-β1mRNA的表达均显著降低。3、各组系膜细胞的凋亡情况对照组系膜细胞有一定的凋亡率,高糖组系膜细胞早期凋亡和晚期凋亡显著增加,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,作用于高糖培养的MCs,可抑制高糖培养系膜细胞的凋亡。4、系膜细胞Bcl-2和Caspase-3的表达情况正常对照组系膜细胞表达高水平的Bcl-2和低水平的Caspase-3,高糖组作用后Bcl-2表达降低,Caspase-3表达升高,较对照组差别有统计学作用,rHuEPO在1、10、50、100IU/ml时,Bcl-2蛋白表达量增加,Caspase-3蛋白表达量降低,与高糖组比较有统计学作用。结论1、高糖在一定浓度和时间内有刺激系膜细胞增殖的效应,大剂量1000IU/ml rHuEPO对高糖培养的系膜细胞有细胞毒性,小剂量(1-100IU/m1)rHuEPO可刺激高糖培养的系膜细胞的增殖,呈浓度和时间依赖性。2、高糖增加系膜细胞MCP-1、TGF-β1蛋白和mRNA的表达,1-100IU/ml rHuEPO能抑制高糖培养的MCs MCP-1、TGF-β1蛋白和mRNA的表达。3、高糖培养的系膜细胞凋亡增加,rHu论文导读：可以在患者尿液中和超滤液中检测到。文献报道体内铁负荷、慢性炎症和IL-6可以使hepcidin水平升高,贫血,缺氧和rHuEPO治疗可以使hepcidin水平下降。Hepcidin与膜铁转运蛋白(FP1)结合发挥作用,后者在十二指肠、肝细胞及巨噬细胞有着高表达,FP1水平降低时,hepcidin可抑制铁的释放,hepcidin在慢性病的贫血中发挥重要作用。近年探
EPO能抑制高糖培养的MCs的凋亡,可能与凋亡相关的基因Bcl-2表达上调,Caspase-3表达下调有关。探讨背景和目的贫血是终末期肾脏病(ESRD)血液透析(HD)患者最常见的并发症,贫血可以引起患者组织氧供减少、左室肥厚(LVH)、充血性心力衰竭(CHF)、肌肉易疲劳、运动耐力和机体免疫力下降等,ESRD HD患者死亡率升高。重组人促红细胞生成素(rHuEPO)在临床的广泛运用大大减少了肾性贫血的发生率,大部分肾性贫血得到了有效的治疗,但rHuEPO的反应性在不同的患者体现不同,大约90-95%的患者对rHuEPO有良好的反应性,血红蛋白水平能维持在11-12g/dl或以上水平,但5-10%的ESRD患者rHuEPO反应性差或无反应,血红蛋白水平不能维持在11-12g/dl或以上水平,有着显著的rHuEPO抵抗。文献报道,许多因素参与rHuEPO抵抗的发生,包括铁缺乏、慢性炎症、急性感染、失血、功能亢进、VitB12和叶酸缺乏等。其中最常见的一个理由是铁缺乏。其中包括了铁的绝对不足以及功能性铁缺乏。功能性铁缺乏是指体内铁储备充分,而铁不能被充分利用。但一部分患者铁补足后,仍有着rHuEPO抵抗。rHuEPO抵抗的另一个重要理由归因于慢性炎症,但这些因素排除后,仍有一些患者有着rHuEPO抵抗。Hepcidin是一种由肝脏细胞产生的由25个氨基酸组成的具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽,属于防御性蛋白家族。近年探讨发现铁调素(Hepcidin)在维持铁代谢平衡中起着关键性的调控作用,参与多种铁代谢疾病的发病机制。Hepcidin可以在患者尿液中和超滤液中检测到。文献报道体内铁负荷、慢性炎症和IL-6可以使hepcidin水平升高,贫血,缺氧和rHuEPO治疗可以使hepcidin水平下降。Hepcidin与膜铁转运蛋白(FP1)结合发挥作用,后者在十二指肠、肝细胞及巨噬细胞有着高表达,FP1水平降低时,hepcidin可抑制铁的释放,hepcidin在慢性病的贫血中发挥重要作用。近年探讨发现细胞因子介导的炎症抑制骨髓红细胞的生成为ESRD患者贫血的一个重要理由,体现为C反应蛋白(CRP)升高,认为慢性炎症可能为rHuEPO抵抗性贫血的一个重要理由。HD透析患者慢性炎症可以调节hepcidin生成,血液透析患者hepcidin水平升高。但是hepcidin在肾性贫血中的发病机制仍不是很清楚。有探讨表明ESRD患者hepcidin在体内蓄积,HD患者不同的透析方式可对hepcidin的水平产生影响。目前由于hepcidin分子量小,检测较困难,对设备要求较高,限制了广泛运用,我们通过测定其前体pro-hepcidin水平了解体内hepcidin水平。该课题通过临床观血液透析肾性贫血患者与促红素抵抗患者体内pro-hepcidin的水平、炎症因子(hs-CRP)以及铁代谢状态,探讨pro-hepcidin与rHuEPO抵抗肾性贫血、慢性炎症及铁代谢状态的相互联系,观察pro-hepcidin是否参与rHuEPO抵抗肾性贫血的发病,为将来接受EPO治疗患者提供有效的诊断和决策参考。探讨目的如下：1、ELISA法测定MHD患者、rHuEPO抵抗性贫血患者及健康对照者血清pro-hepcidin水平。2、浅析ESRD MHD患者rHuEPO抵抗与铁代谢、慢性炎症和pro-hepcidin之间的联系。3、ROC曲线预测hepcidin对rHuEPO抵抗的诊断价值。材料与策略1.MHD患者40例入选,其中20例为rHuEPO反应良好组,20例为rHuEPO抵抗组,另选择20例健康体检者作为对照组。2.一般资料采集：血液透析患者均于透析前动静脉瘘处取血，健康对照组于清晨空腹取肘静脉血。分别检测血红细胞计数，血红蛋白浓度，红细胞积压，及肝肾功能等生化指标，pro-hepcidin、hs-CRP、铁代谢指标。3.测定指标：HD患者和健康对照常规检测血液学指标及生化指标,铁代谢指标包括血清铁蛋白、血清铁和总铁结合力(计算转铁蛋白饱和度)、iPTH、叶酸和VitB12, MHD患者测定透析前后血尿素氮和肌酐水平。4.检测策略：(1)血清Pro—hepcidin:ELISA策略(2)血清hs-CRP:透射比浊法测定。(3)血清铁蛋白：微粒子发光法检测。(4)血清铁和总铁结合力：亚嗪比色法测定,计算出转铁蛋白饱和度(TSAT) TSAT=(血清铁/总铁结合力)×100。(5)叶酸和VitB12:微粒子酶联免疫法检测。(6)iPTH：电发光法检测。(7)透析充分性计算：Kt/V=-ln(R-0.008t)+(4-3.5R)UF/W URR=100(1-Ct/Co)(8)常规检测血脂、肾功、肝功等生化指标、血细胞各项参数。5.统计策略：运用SPSS13.0软件包进行统计学处理,符合正态分布或近似正态分布的计量资料以x±s表示,用独立样本t检验浅析组间差别,计数资料采取χ2检验,影响EPO反应性的因素采取Spearman等级相关浅析,以P0.05表示差别有统计学作用,多元逐步回归浅析影响pro-hepcidin的因素,ROC曲线预测pro-hepcidin对EPO抵抗的诊断价值。结果HD患者血清铁蛋白、血清pro-hepcidn、hs-CRP显著高于正常患者,TF显著低于正常患者,EPO抵抗的患者血清铁蛋白、血清pro-hepcidin、hs-CRP显著高于反应正常的患者。血清pro-hepcidin水平与血清铁蛋白和hs-CRP密切相关,多元逐步回归浅析显示影响血清pro-hepcidin的因素有、SI和hs-CRP,预测EPO抵抗诊断价值的ROC曲线示pro-hepcidin、和hs-CRP的曲线下面积分别为0.713、0.769、0.958,其中hs-CRP预测价值最大。结论HD患者pro-hepcidin水平显著升高,rHuEPO抵抗与慢性炎症、铁代谢水平密切相关,血清pro-hepcidin、、hs-CRP是rHu论文导读：系人员哦。第一部分重组人红细胞生成素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞的作用8-69摘要8-12ABSTRACT12-16符号说明16-18前言18-21材料和策略21-32结果32-47讨论47-56结论56-57附图57-61参考文献61-69第二部分血透患者促红细胞生成素抵抗和hepcidin相关探讨69-108摘要69-72AB
EPO抵抗的标志。关键词：重组人红细胞生成素rHuEPO论文系膜细胞论文高糖论文增殖论文凋亡论文血液透析论文rHuEPO抵抗论文pro-hepcidin论文铁代谢论文超敏C反应蛋白论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。第一部分 重组人红细胞生成素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞的作用8-69
摘要8-12
ABSTRACT12-16
符号说明16-18
前言18-21
材料和策略21-32
结果32-47
讨论47-56
结论56-57
附图57-61
参考文献61-69
第二部分 血透患者促红细胞生成素抵抗和hepcidin相关探讨69-108
摘要69-72
ABSTRACT72-76
符号说明76-77
前言77-80
材料和策略80-83
结果83-94
讨论94-101
结论101-102
参考文献102-108
致谢108-109
攻读博士学位期间的学术成果109-110
学位论文评阅及答辩表110-111
外文论文一111-126
外文论文二126-141