试议软骨软骨组织工程种子细胞运用对策及耳廓软骨组织构建设计

论文导读：
摘要：探讨背景及作用：耳廓软骨组织工程为耳软骨缺损的修复重建提供了新的治疗思路,其中种子细胞是限制其进展及临床运用的瓶颈之一。目前,构建组织工程软骨主要通过三种方式来实现：(1)单独运用各种来源的软骨细胞；(2)单独运用成软骨诱导后的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs);(3)将软骨细胞与MSCs混合共培养。上面陈述的三类种子细胞运用案例以细胞生物学基础与临床运用的角度上讲各存利弊,但目前尚缺乏关于此类不足的深入探讨；此外,针对先天性小耳畸形,自体残耳组织是外耳重建重要的种子细胞来源,目前对残耳组织来源细胞及其软骨构建系统化的探讨较少,确立最佳的种子细胞运用对策能够为耳廓软骨组织工程突破目前困境及进展未来运用提供论述基础和技术支持。探讨目的：1、通过在组织学、基因表达及生物学功能等方面系统比较单纯运用软骨细胞、软骨细胞与BMSCs混合共培养、BMSCs成软骨诱导三类种子细胞运用案例,确立构建弹性软骨最佳的种子细胞运用对策并探讨其构建耳廓形态软骨的可行性。2、通过浅析残耳软骨细胞的体外增殖、表型变化、细胞组织的量效联系以及探讨传代、诱导对其体内成软骨能力的影响,确立基于残耳软骨细胞的种子细胞运用对策及其构建耳廓形态软骨的可行性。探讨内容：1.不同种子细胞及运用案例构建组织工程软骨1.1比较不同组织来源软骨细胞构建组织工程软骨的差别策略选择耳廓和关节两种不同组织来源的软骨细胞接种PGA/PLA支架构建组织工程软骨组织,在其体外和体内的不同构建阶段,通过组织学检测进行观察,比较两组构建物是否因细胞的组织来源不同而有着差别。结果耳廓和关节来源的软骨细胞构建的软骨组织在体外未发现组织学水平的差别,但植入皮下6周后均恢复了各自的生物学特性,关节软骨细胞组发生了部分骨化,耳廓软骨细胞组出现了弹性纤维的阳性着色。小结体外构建的组织工程软骨植入体内后能恢复软骨细胞组织来源的特性,可在皮下构建与软骨细胞来源类型相同的组织工程软骨。1.2比较三类种子细胞运用案例构建组织工程软骨的差别策略系统性比较单独运用耳廓软骨细胞、单独运用骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)并对其进行成软骨诱导、以及耳廓软骨细胞与BMSCs混合共培养构建的组织工程软骨在组织学、基因表达及生物力学功能方面有着的差别。结果复合物在植入体内6周后,BMSCs诱导组不仅不能构建弹性软骨组织而且发生了显著的骨化,COL10A1、MMP13、ALPL的表达较其余两组出现显著升高；耳廓软骨细胞与BMSCs混合共培养组不仅可保持稳定的软骨表型,而且相较单纯耳廓软骨细胞组其弹性纤维更为均质、密集,弹性模量也更高且与生理耳廓软骨无统计学差别,COL9A1、COMP、DCN、LOXL2的表达也有统计学作用的升高。此外,共培养构建的软骨组织其D1k1与Ki67的表达也高于单纯耳廓软骨细胞组。小结耳廓软骨细胞与BMSCs混合共培养是目前构建弹性软骨组织最佳的种子细胞运用对策,其构建的弹性软骨具备更密集的弹性纤维和更高的弹性模量,并且可延续干细胞带来的增殖与分化能力。1.3软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养构建耳廓软骨策略将猪自体耳廓软骨细胞与BMSCs以5：5的比例混合接种于预成型的耳廓形态PGA/PLA支架上,体外培养10周,植入猪耳后皮下20周后进行软骨相关检测。结果猪耳廓软骨细胞与BMSCs以5：5的比例混合共培养能够在体外构建良好形态及弹性的耳廓软骨,在植入大动物体内20周后仍然能够稳定存活,且其组织学与弹性相较生理耳廓软骨无显著差别,但是最终难以维持耳廓的精细形态。小结在大动物体内实验中,共培养构建的耳廓软骨能够稳定存活20周,但因不能对抗皮肤收缩力最终难以维持耳廓的精细形态。2.先天性小耳残耳软骨细胞构建组织工程软骨2.1残耳软骨细胞的增殖、表型变化及量效联系探讨策略通过对大量残耳组织进行称重和细胞分离计数,计算残耳组织的初始细胞获得率；通过绘制生长曲线和细胞计数探讨4代以内残耳软骨细胞在bFGF影响下的增殖能力及扩增倍数；在细胞和基因水平检测传代对残耳软骨细胞表型的影响;并通过大量软骨相关基因谱的筛查比对残耳软骨细胞与正常耳软骨细胞在基因水平的异同。结果残耳组织的初始细胞获得率为(3.90±1.27)×106/g；残耳软骨细胞在bFGF的刺激下增殖能力显著提升,4代以内增殖能力未见差别,且扩增至P4代能够达到(328.4±50.4)倍的增殖效率；但是,同样条件下扩增至P3代的残耳软骨细胞其番红O染色、Ⅱ型胶原的基因表达已较弱,至P4代基本检测不到；此外,残耳软骨细胞在基因水平除个别个体的COL2A1成熟型异构体COL2A1V2及COL9A1的表达偏低外,与正常耳软骨细胞相较未见显著差别。小结残耳组织来源细胞与正常耳廓软骨细胞相比在基因水平未见显著差别,在bFGF培养下增殖到P3代仍可维持一定程度的软骨表型且能达到构建常人体积耳廓软骨的细胞数量(以获得500mg残耳组织计算)。2.2体外传代及诱导对残耳软骨细胞体内成软骨能力的影响策略将P3-P8代残耳软骨细胞各自接种PGA/PLA支架进行软骨组织构建,根据组织学、基因表达和生物力学结果浅析体外传代及诱导对其最终体内成软骨能力的影响。结果在P3-P8各代次细胞材料复合物中,P4代以前在体外4周可较高表达SOX9和DLK1,并能在体内形成良好的弹性软骨组织；经过体外诱导,P3-P8代的残耳软骨细胞材料复合物均能在体外形成类软骨组织,但DLK1的表达却均显著低于非诱导组,且其体内8周后的成骨现象十分显著。小结P4代以前的残耳软骨细胞不经体外诱导虽然不能在体外构建耳廓软骨,但仍可保持良好的体内成软骨能力形成弹性软骨。P3-P8代细胞经体外诱导可以形成类软骨组织,但是其体内的成骨倾向较为严重,DLK1可能在体外成软骨诱导致体内成骨历程中扮演重要角色。2.3单例先天性小耳残耳软骨细胞构建常人体积耳廓软骨策略将单例病人残耳组织分离的软骨论文导读：
细胞在体外传至P3或P4代,在生长因子、藻酸盐凝胶、旋转培养的体外再分化系统中培养10周后进行软骨相关检测,以体外普通培养(不诱导)作为对照。结果利用单例先天性小耳的残耳组织经过细胞扩增和再分化系统培养可以在体外构建常人体积的耳廓形态软骨,所形成的软骨组织结构较接近正常生理软骨组织。小结大量增殖的残耳软骨细胞在再分化诱导系统培养下能够在体外构建常人体积的耳廓软骨。综上所述,本探讨以耳廓软骨构建为最终目的,探讨了几种软骨组织工程种子细胞及其运用对策的可行性。明确了耳廓软骨细胞与BMSCs共培养案例在构建弹性软骨方面的优势,首次运用其在体外构建耳廓形态组织工程软骨并进行大动物体内探讨。同时,系统探讨了残耳软骨细胞构建软骨组织的量效联系及运用案例,并在体外构建常人体积耳廓软骨。这些探讨结果为耳廓软骨组织工程的临床运用提供了论述基础和技术支持。关键词：软骨组织工程论文耳廓软骨论文软骨细胞论文BMSCs论文共培养论文残耳软骨细胞论文
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Abstract9-16
前言16-21

一、软骨缺损与组织工程16

二、软骨组织工程及其种子细胞16-19

三、耳廓软骨的组织工程化构建及其困境19

四、探讨基础及设想19-21

第一部分 不同种子细胞及运用案例构建组织工程软骨21-65
第一章 不同组织来源软骨细胞构建组织工程软骨22-34
第二章 不同种子细胞运用案例构建组织工程软骨34-57
第一节 组织学及生物力学功能评价35-44
第二节 共培养案例的优势及机制探讨44-57
第三章 软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养构建耳廓软骨57-65
第二部分 先天性小耳残耳软骨细胞构建组织工程软骨65-101
第一章 残耳软骨细胞的增殖、表型变化及量效联系探讨66-76
第二章 传代及诱导对残耳软骨细胞体内成软骨能力的影响76-101
第一节 体外传代对残耳软骨细胞体内成软骨能力的影响77-86
第二节 体外诱导对残耳软骨细胞体内成软骨能力的影响86-94
第三节 运用单例先天性小耳残耳软骨细胞构建正常人体积耳廓软骨94-101
全文结论101-102
文献综述102-107
参考文献107-113
英文缩略语表113-115
致谢115-116
所发表文章和学术交流情况116-117