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对于止血剂战场严重四肢伤分级救治系列产品流程

最后更新时间:2023-12-30 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:29764 浏览:133708
论文导读:
摘要:一、目的:本探讨立足于我军战时严重四肢伤分级救治的实际需要,着力探讨一系列有望运用于四肢伤救治的产品和技术,具体包括新型壳聚糖急救止血剂、锁定暂时性血管分流装置、自体血凝块预混的冻干骨和凝血酶原。通过本探讨,试图为上面陈述的产品的后续研发提供论述基础和实验依据。具体而言,本探讨分为以下三个方面:着眼于四肢伤的战(现)场急救阶段,我们针对现有壳聚糖急救止血剂(chitosan-based first aid hemostat, CFAH)水下粘附力差,止血效果欠佳的不足,开展了壳聚糖急救止血剂化学修饰的初步探讨,并对止血剂的止血及粘附机理进行初步探讨,旨在为进一步提升壳聚糖急救止血剂水浸条件下的止血效果而提供论述基础和实验依据。着眼于四肢伤的紧急救治阶段,我们针对美军目前正在利用的暂时性血管分流(temporary vascular shunt, TVS)的分流管固定费时、不牢靠,脱出率高的不足,设计了独具螺纹和配套锁定螺母的分流装置——锁定暂时性血管分流(locked temporary vascular shunt, LTVS)装置,旨在进一步提升TVS技术的救治效率和安全性。着眼于四肢伤的早期治疗阶段,我们针对大段骨缺损修复时骨不连、骨延迟愈合等难题,探讨了新型异体骨填充材料——自体血凝块预混的冻干辐照异体骨(autologous coagula impregnated freeze-dried irradiated allograft bone,ACIFIAB)。同时,针对现有组织工程缓释技术有着的局部因子的高浓度与因子最佳效应浓度不一致的矛盾,提出了“原料修复对策”(material repair strategy,MRS),并探讨了有望推动冻干异体骨改建的新的促成骨因子——凝血酶原(prothrombin, PT),旨在进一步改善骨移植材料的血液供应和推动成骨。二、策略:在CFAH止血机制及改性的初步探讨性探讨方面,我们首先尝试通过Schiff碱合成和多肽合成的策略对壳聚糖急救止血剂进行化学改性,分别合成了经3,4-二羟基苯甲醛修饰的壳聚糖(DHBH modified chitosan, DMCTS)和经左旋多巴修饰的壳聚糖(DOPAmodified chitosan, DOPAMCTS),通过傅立叶红外光谱浅析、凝血试验以及扫描电镜等手段对上面陈述的两种改性的壳聚糖和几种包括甲壳素、壳聚糖、Celox止血剂、乌鱼骨等在内的止血剂进行理化表征,并通过止血及粘附效果的比较浅析,进一步以物理及化学两个层面对止血剂的止血及粘附机制进行深入探讨。在LTVS装置的探讨方面,我们设计了独具螺纹和配套锁定螺母的分流装置。然后通过体外血管爆破压试验评价其吻合强度;通过犬股动脉、髂总动脉损伤模型评价其吻合效率;通过组织学策略评价吻合部位血管壁组织的卡压损伤情况。在ACIFAB的探讨方面,我们首先通过体外限制性压缩实验来比较和评价不同异体骨材料的力学性能,随后通过异位植骨实验及其后的HE染色、血小板内皮细胞粘附分子1(platelet endothepal cell adhesion molecule-1,PECAM-1)免疫组化染色、Masson染色以及针对VEGFα的qRT-PCR等策略来评价自体血凝块对异体骨血管化和改建的影响,并用Image-Pro Plus图像浅析软件对经免疫组化染色显示的双侧植入物内血管面积及数目进行定量浅析。在PT的探讨方面,我们首先通过ELISA、CCK8、RT-PCR及qRT-PCR等策略体外评价凝血酶原对成骨细胞增殖及分泌BMP-2的影响。继而,通过兔双侧桡骨缺损模型和术后X线评分及缺损面积定量浅析的策略评价自体凝血酶原对大段骨缺损的修复效果。随后,我们通过免疫组化的策略观察新鲜骨组织内经骨库制备技术处理后凝血酶原的变化。最后,我们制备了以壳聚糖-PLGA微球为缓释载体的复合人凝血酶原冻干辐照异体骨(humanprothrombin impregnated freeze-dried irradiated allograft bone, HPIFIAB),并通过扫描电镜观察了其表面形貌,并通过ELISA测试了其于体外对PT的缓释性能。三、结果:1.CFAH的止血机制及改性探讨傅立叶红外光谱图提示,Celox止血剂与国产水溶性壳聚糖均含有代表N-H键的伸缩振动峰;DMCTS样品的光谱图上出现了我们预期的C=N双键及苯环特点峰;在DOPAMCTS分子中,DOPA的邻苯二酚和氨基均链接到了壳聚糖的侧链上。凝血试验的结果提示,甲壳素不具备促凝作用;经修饰为DMCTS后,壳聚糖的促凝作用消失;而壳聚糖、Celox止血剂以及DOPAMCTS均具有显著的促凝作用,各组的凝血时间具有显著性差别(p=0.000)。另,未经研磨的乌鱼骨块,具备优异的促凝血性能,而经过反复研磨后的乌鱼骨粉其促凝作用消失,两组的凝血时间具有显著性差别(p=0.000)。扫描电镜结果提示,完整的乌鱼骨块表面高度整齐划一,而经研磨的乌鱼骨粉末其原有的表面形貌被破坏,与壳聚糖颗粒一样,表面则极不规则。经近乎相等的水流冲刷作用下,国产壳聚糖与乌鱼骨颗粒在横纹肌组织表面的存留情况显著不同。其中,粘附于横纹肌表面的壳聚糖颗粒在水流冲刷的作用下全部消失;乌鱼骨颗粒在水流冲刷的作用下仍然与组织牢固粘附;乌鱼骨与壳聚糖的等比例混合颗粒仅有极少数存留;先撒乌鱼骨,后撒壳聚糖的组织表面仍有较多颗粒存留。2.LTVS装置的探讨体外爆破压测定的结果提示,经锁定螺母固定的血管残端其爆破压的实测值比经普通缝线结扎固定者高114.29%(p=0.000)。LTVS的吻合时间可比TVS的吻合时间缩短60.37%(p=0.000)。虽然经过丝线或塑料螺纹持续1周的卡压,吻合口处的血管壁组织(特别是血管肌层)仍然能够维持其结构的连续性。3.ACIFAB的探讨异位植骨实验的大体标本提示,术后8周时,在同一只大鼠体内,实验侧植入物表面已经有大量的新生血管长入论文导读:H相当,最高峰也出现在12h,且峰值较TH更高;空白对照组BMP-2的高峰出现得最早,且24h的浓度最低。ELISA的结果还提示,当TH分别以0、0.1、1、10、25μg/ml的浓度梯度刺激成骨细胞时,BMP-2的分泌高峰出现在10μg/ml;而PT刺激组的分泌高峰出现在1μg/ml;TH+PT刺激组的分泌高峰则出现在10μg/ml。经RT-PCR证实,1ug/ml的PT会推动成骨
,而对照侧植入物表面未见显著的血管长入。HE染色提示,到了术后第4周和第8周,实验侧的新生血管密度显著高于对照侧。免疫组化染色提示,在术后1周,双侧均未见显著的管腔样组织被染成PECAM-1阳性,但在血凝块植入侧,可见大量的团块状物质被PECAM-1阳性识别;在术后4周和8周,在同一只宿主体内,实验侧的PECAM-1阳性染色区域显著较对照侧多,且大部分集中于管腔状结构周围。定量浅析结果提示,在术后1周、4周及8周,实验侧植入物内的血管面积较对照侧相比均增大,且差别具有统计学作用(p=0.035)。Masson染色提示,在术后第1周,实验侧与对照侧的异体骨颗粒均呈散在分布,无显著基质生成,而且,实验侧视野内可见大小不一的血凝块颗粒;在术后第4周,实验侧的异体骨颗粒已被新生的基质包围并连成片状,其间分布着大量的蚯蚓状血管组织,而对照侧异体骨周围的基质连接并不完全,基本上仍呈各自分散的状态,其间并未见显著的血管状组织;在术后第8周,实验侧的基质进一步成熟,密度增加,大量的异体骨颗粒呈现溶解吸收,其间也可看到大量的蚯蚓状血管组织,而对照侧异体骨周围的基质融合也进一步增强,但程度不及实验侧,且未见大量的血管组织及显著的异体骨溶解。qRT-PCR的结果提示,在术后1周,实验侧植入物标本中VEGFα的表达显著高于对照组(p 0.05)。而到了术后第4周和第8周,双侧植入物标本中VEGFα的表达无显著性差别。体外限制性压缩实验的结果提示,新鲜冷冻骨的刚度(stiffness, S)和弹性模量(elastic modulus, EM)略高于复水后的冻干骨(p 0.05)。且经过新鲜血凝块或壳聚糖溶液预混后,冻干骨的S及EM进一步降低(p 0.05)。经过渐进式打压,各组异体骨块的压缩率(ratio of compression, RC)显著升高(p=0.000),而各组骨块的压缩变化率(delta ratio of compression,ΔRC)显著降低(p=0.000)。相关浅析的结果提示,ΔRC与打压次数(Impacts, I)呈负相关(Pearson相联系数为-0.711,p=0.000),与S呈负相关(Pearson相联系数为-0.229,p=0.000),与骨块高度(Height, H)呈正相关(Pearson相联系数为0.482,p=0.000),与EM无显著相关性(Pearson相联系数为-0.053,p=0.231)。以ΔRC为因变量的回归方程为,Δ R_i=0.0590.0004327585881334×I_i+0.0004563645521868×H_i该方程的R~2值为0.516,p=0.000。其中I_i代表打压次数;Hi代表在第i次打压前沿打压方向测量的骨块高度值。4.PT的探讨4.1.PT促成骨细胞增殖CCK8结果提示,当体外无血清培养条件下分别以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的浓度刺激大鼠成骨细胞时, PT对细胞的增殖体现出了不同程度的推动作用,且相比之下,1μg/ml的推动作用最显著;而相同浓度梯度的凝血酶(thrombin, TH)则对细胞的增殖体现出了不尽相同的作用:当TH的刺激浓度为0.1μg/ml时,无显著的推动或抑制作用,当TH的刺激浓度为1μg/ml时,体现出了一定程度的推动作用,但当TH的浓度高于10μg/ml时,则对成骨细胞的增殖呈现出抑制作用,且浓度越高,抑制作用越显著。PT+TH的促增殖作用在1μg/ml时达到了顶峰,而当刺激浓度继续升高时,则推动作用逐渐减弱,但并不呈现出显著的抑制作用。CCK8结果还提示,在含10%胎牛血清培养条件下,PT对大鼠成骨细胞的增殖能够起到一定的推动作用。特别是较低浓度的PT (0.014μg/ml),能够达到最佳的推动效果。4.2.PT促成骨细胞表达及分泌BMP-2ELISA的结果提示,当以0.5μg/ml为起始浓度刺激大鼠成骨细胞时,TH促成骨细胞分泌BMP-2的高峰出现在刺激后的12h,随后开始下降;而PT的促分泌效果在24h的观察周期内始终呈上升走势;TH+PT的促分泌走势与TH相当,最高峰也出现在12h,且峰值较TH更高;空白对照组BMP-2的高峰出现得最早,且24h的浓度最低。ELISA的结果还提示,当TH分别以0、0.1、1、10、25μg/ml的浓度梯度刺激成骨细胞时,BMP-2的分泌高峰出现在10μg/ml;而PT刺激组的分泌高峰出现在1μg/ml;TH+PT刺激组的分泌高峰则出现在10μg/ml。经RT-PCR证实,1ug/ml的PT会推动成骨细胞对BMP-2的表达增强。qRT-PCR的结果也证实,经0.1mg/ml的PT刺激后,成骨细胞对BMP-2的表达显著增强(p=0.000)。4.3.自体PT推动骨修复兔双侧桡骨缺损修复术后的X线评分结果提示,术后1w时,自体PT修复侧(实验侧)与对照侧的评分值均为0。随着观察时间的延长,双侧的骨缺损都有渐进性的修复,体现在X线评分则为分值逐渐增加。而且,自术后4w始,实验侧的分值显著高于对照侧分值(p=0.021)。图像浅析的结果提示,在术后1w、4w、8w及16w,实验侧缺损面积均小于对照侧,以术后8w最显著,且差别具有显著性作用(p=0.045)。4.4.骨库制备技术对骨组织中PT的破坏经大鼠凝血酶原免疫组化染色证实,新鲜皮质骨中有着有大量的PT,且大部分与骨细胞一起位于骨陷窝内。而比较发现,经脱脂、脱蛋白、冻干及辐照等处理后,皮质骨内的骨细胞基本上被彻底清除干净,遗留下许多空泡状的陷窝;而与此同时,原本有着于新鲜异体骨中的PT也被清除干净。4.5.HPIFIAB扫描电镜的结果提示,在冻干异体骨的髓腔面,可清晰看到髓腔壁的骨小梁结构,而在皮质面,则能清晰看到皮质骨表面的滋养孔。在经壳聚糖包被冻干异体骨的髓腔面及皮质面,上面陈述的骨组织表面的正常结构被均匀的壳聚糖膜覆盖。经冻干并烘烤后的人PT-PLGA微球,其外形呈表面多孔的圆饼状,论文导读:纯凝血酶原微球的多孔状表面不同,负载于冻干异体骨的微球其表面尚包裹一层光滑的壳聚糖膜。通过ELISA测定出微球的包封率为74.93%,而且在体外测出了经单纯壳聚糖以及壳聚糖-PLGA微球缓释的PT浓度曲线。以曲线上各个时间点两组的PT浓度值可见,以单纯壳聚糖为缓释载体,其溶液中释放出来的PT浓度较以壳聚糖-PLGA微球为高,且各时
直径约为100μm,厚度约为40μm。HPIFIAB髓腔面及皮质面,分布着大小不一的微球,微球直径约为2~10μm。与单纯凝血酶原微球的多孔状表面不同,负载于冻干异体骨的微球其表面尚包裹一层光滑的壳聚糖膜。通过ELISA测定出微球的包封率为74.93%,而且在体外测出了经单纯壳聚糖以及壳聚糖-PLGA微球缓释的PT浓度曲线。以曲线上各个时间点两组的PT浓度值可见,以单纯壳聚糖为缓释载体,其溶液中释放出来的PT浓度较以壳聚糖-PLGA微球为高,且各时间点的浓度均值及标准差起伏较大。相比较而言,经壳聚糖-PLGA微球缓释后,各时间点溶液中PT的浓度均较低,且起伏波动不大,各时间点的浓度标准差也较小。以整体观察周期来看,以单纯壳聚糖为缓释载体的溶液在缓释第一天内出现了“突释”现象,PT的浓度在第一天达到了峰值,而在随后的观察周期内,虽有起伏,但PT浓度整体呈下降走势;而以壳聚糖-PLGA微球为缓释载体的溶液则看不到对PT的“突释”,在长达30天的观察周期内,PT浓度始终维持平稳,没有出现显著的突释现象。四、结论:1.CFAH的止血机制及改性探讨1.1.Schiff碱合成案例与多肽合成案例均能成功地将邻苯二酚结构桥接至壳聚糖,使壳聚糖在化学层面具备了像贝壳一样发生水下粘附的物质基础。1.2.与Schiff碱合成案例相比,多肽合成案例能够在化学修饰壳聚糖的同时保留壳聚糖的止血作用,因而更适合于本项目的后续探讨。1.3.游离氨基对于壳聚糖止血剂的止血性能而言,发挥着“不可或缺”的关键作用。1.4.止血剂微观表面形貌的高度一致性,是其具备粘附特性的必备条件之一。2. LTVS装置的探讨2.1.与美军现有的TVS相比,LTVS的吻合时间可以缩短60.37%。2.2.与美军现有的TVS相比,LTVS的吻合强度至少可以提升114.29%。3. ACIFIAB的探讨3.1.冻干辐照异体骨比新鲜冷冻异体骨软,更容易被打压。3.2.就骨块的瞬时形变率而言,冻干辐照异体骨与新鲜冷冻异体骨不分伯仲,有望为髋臼假体提供相似的初期稳定性。3.3.由于新鲜血凝块尚能推动冻干辐照异体骨的再血管化与骨改建,我们推荐在髋臼翻修时,将冻干异体骨和自体新鲜血凝块预混后一并植入。4. PT的探讨4.1.PT可以推动成骨细胞的增殖及对BMP-2的分泌。4.2.与TH不同,高浓度的PT对成骨细胞的增殖没有显著的抑制作用。4.3.局部补充自体PT可以有效推动大段骨缺损的修复。4.4.现有的骨库技术对骨组织中的PT破坏严重。4.5.借助于缓释技术,PT有望成为一种新型的促成骨因子运用于临床。总之,对壳聚糖急救止血剂止血机制与改性的初步探讨,以物理化学双重层面揭示了止血剂的止血和粘附机制,有望在此基础之上进一步研发兼具止血和粘附性能的优秀止血剂;锁定暂时性血管分流装置,能够缩短吻合时间,增强吻合强度,并进一步提升分流管的抗凝特性,有望进一步提升暂时性血管分流技术的救治效率和安全性;自体血凝块预混的冻干异体骨和凝血酶原,能够进一步改善骨移植材料的血液供应和推动成骨,有望运用于大段骨缺损的治疗。由此,有必要对上面陈述的产品和技术开展后续研发,以而进一步提升我军对战时严重四肢伤的整体救治水平。关键词:四肢伤论文分级救治论文壳聚糖急救止血剂论文锁定暂时性血管分流论文自体血凝块预混的冻干异体骨论文原料修复对策论文凝血酶原论文
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Abstract16-23
前言23-25
第一章 壳聚糖急救止血剂的止血机制及改性探讨25-54
第一节 、探讨背景25-34

一、 急救止血剂的定义25

二、 理想的急救止血剂应满足的条件25-26

三、 目前较常用的几类急救止血剂26-32

四、 国内基于壳聚糖的几类止血剂专利32-33

五、 探讨目标33-34

第二节 、材料与策略34-38

一、制备经 3,4-二羟基苯甲醛修饰的壳聚糖34-35

二、 止血剂化学结构的鉴定35

三、 止血剂粘附性能的测试35-36

四、 凝血试验36

五、制备经 L-DOPA 修饰的壳聚糖36-37

六、 止血剂的空间表面结构对组织粘附力的影响37-38

第三节 、结果与讨论38-52

一、 通过傅立叶红外光谱浅析进一步验证了CeloxTM止血剂的基本组成38-39

二、通过红外光谱浅析验证了 Schiff 碱改性路线的可行性39-41

三、DMCTS 的粘附性能仍不足41-42

四、通过第一次凝血试验发现了 DMCTS 促凝血作用的消失42-44

五、 新的壳聚糖改性案例——多肽合成案例44-45

六、 通过红外光谱浅析验证了多肽合成案例的可行性45-46

七、 游离氨基“不可或缺”的关键性作用46-47

八、 止血剂的微观表面结构对其粘附力及止血性能的影响47-51
九、 本部分探讨结果的作用51-52
第四节 、不足之处及后续的研发方向52
第五节 、结论与革新点52-54
第二章 新型暂时性血管分流装置的探讨54-70
第一节 、探讨背景54-56
第二节 、材料与策略56-61

一、 新型暂时性血管分流装置的改良设计56-57

二、LTVS 的利用策略57

三、 效果评价57-61

第三节 、结果61-63

一、 体外爆破压的测定61

二、 体内吻合时间的比较61-62

三、 吻合口处血管壁的组织学观察62-63

第四节 、讨论63-68
第五节 、不足之处及后续的研发方向68-69
第六节 、结论与革新点69-70
第三章 新型异体骨填充材料——自体血凝块预混的冻干异体骨70-101
第一节 、探讨背景70
第二节 、新鲜血凝块对冻干辐照骨颗粒基本力学性能的影响70-85

一、 探讨背景70-73

二、 材料与策略73-79

三、 结果79-83

四、 讨论83-85

第三节 、新鲜血凝块对异体骨血管化及改建的影响85-99

一、 材料与策略85-90

二、论文导读:

结果90-97

三、 讨论97-99

第四节 、不足之处及后续的研发方向99-100
第五节 、结论与革新点100-101
第四章 运用于骨组织工程的凝血酶原101-140
第一节 、探讨背景101-102
第二节 、凝血酶原对大鼠成骨细胞的影响102-118

一、 以凝血酶到凝血酶原102-106

二、 材料与策略106-112

三、 结果112-117

四、 讨论117-118

第三节 、自体PT修复骨缺损的动物体内评价118-126

一、 材料与策略118-121

二、 结果121-124

三、 讨论124-126

第四节 、冻干辐照对新鲜异体骨内 PT 成份的破坏126-128

一、 材料与策略126

二、 结果126-127

三、 讨论127-128

第五节 、负载人凝血酶原的冻干异体骨128-138

一、 材料与策略128-130

二、 结果130-135

三、 讨论135-138

第六节 、不足之处及后续的研发方向138
第七节 、结论与革新点138-140
第五章 现代战争中的血管伤(文献综述)140-165
第一节 、历史性回顾与流行病学特点141-144

一、 历史性回顾141

二、 流行病学特点141-144

第二节 、现代战争中血管伤的处理144-161

一、 院前止血144-146

二、 损伤制约复苏术146-148

三、 暂时性血管分流148-149

四、 血管成像和腔内血管治疗149-150

五、 为血管伤伤员尽早做决定150-151

六、 血管伤的评估151-152

七、 血管伤的处理152-156

八、 血管重建术后的处理156-158
九、 创面处理158-159
十、 术后并发症和截肢159-161
第三节 我军与美军血管伤分级救治系统浅析161-165

一、 我军血管伤分级救治系统浅析161-163

二、 美军血管伤分级救治系统浅析163-165

参考文献165-176
略缩词表176-178
攻读学位期间的主要工作178-179
致谢179-180