简析转染磁性纳米粒子细胞内吞及基因转染

论文导读：
摘要：磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles, MNPs）具有广阔的生物医学运用前景，包括磁共振造影、细胞标记、药物/基因载体、肿瘤热疗等。磁性纳米粒子与细胞的相互作用探讨是其生物医学运用的基础。近年来，关于纳米粒子的细胞内吞探讨取得了许多进展。然而，纳米粒子的尺寸及表面电荷对内吞的影响尚有着广泛争议；相同的细胞对不同理化性质的纳米材料的内吞有着着差别性；不同的运用目的对纳米粒子的内吞的要求也不同；细胞对MNPs的内吞规律在体外和体内也有着较大的差别。由此，本论文以以下三方面进一步探讨了细胞对MNPs的内吞：ⅰ）人肺腺癌细胞SPC-A1对谷胱甘肽（氧化型谷胱甘肽，Oxidizedglutathione, GSSG）修饰的纳米磁粒MNPs-GSSG的生物相容性及内吞规律探讨。探讨结果表明MNPs-GSSG生物相容性好，可被SPC-A1细胞高效内吞，且在细胞内能长期滞留。SPC-A1细胞对MNPs-GSSG的内吞是需要能量的、浓度及时间依赖性的内吞。MNPs-GSSG粒子的安全性、细胞内吞的高效性、在细胞内的长期滞留以及细胞内吞量的可控性，对于磁共振造影、细胞标记以及热疗等生物医学运用都具有重要的作用。ⅱ）SPC-A1及WI-38（人胚肺细胞）对氨基硅烷（γ-氨丙基三乙氧基硅烷， γ-Aminopropyl triethoxysilane, APTES）修饰的纳米磁粒MNPs-APTES的内吞量比较探讨。两种细胞对MNPs-APTES的内吞量有着巨大差别，且粒子在SPC-A1细胞中可长时间滞留。这对于癌细胞的体内磁共振造影、细胞示踪及肿瘤热疗具有重要的作用。ⅲ）SPC-A1对MNPs-GSSG，MNPs-APTES的内吞机制探讨。结果表明大小相似的两种粒子的内吞机制不同，这说明表面修饰比粒径大小对内吞机制的影响要大。这提示我们可以通过转变MNPs表面修饰来转变其内吞机制以适应不同的运用目的。近年来非病毒载体由于成本低、制作方便而进展迅速，然而，如何提升非病毒基因的转染效率仍然是基因转染的瓶颈。2002年出现并进展起来的磁转染（Magnetofection）技术能够提升非病毒载体的转染效率。然而，MNPs与非病毒载体之间究竟采取何种方式构建转染载体才能有效提升非病毒载体的转染效率，并没有统一的准则和指导思想。这部分归因于磁转染的机理并不清楚，也就是说构建成的磁转染复合体各组分在细胞内的命运及在转染历程中的作用需要进一步探讨、诠释。本论文比较了表面不同电荷特性的的MNPs的磁转染性能，发现不论带正电性的聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）纳米磁粒MNPs-PEI，还是带负电性的柠檬酸（citric acid, CA）纳米磁粒MNPs-CA、羧葡聚糖（carboxymethyldextran, CMD）纳米磁粒MNPs-CMD，都可以和转染载体（PEI或脂质体）及pDNA（质粒DNA，plaid DNA）靠静电自组装形成磁转染复合体（magnetofectins）。静电自组装构建的磁转染复合体能够提升PEI或脂质体的基因表达水平和/或阳性细胞表达率，且缩短了转染时间。然而，磁转染效率具有细胞系依赖性，细胞类别不同，转染效率差别较大。本论文重点探讨了磁转染复合体的各个组分在细胞内的途径、命运及作用。通过多种浅析表征探讨发现，MNPs在转染中的作用为将转染复合体拉到细胞表面，并且在进核之前与PEI/pDNA复合体分离；本论文证明自由PEI而不是包覆在MNPs上的PEI对转染起到重要的作用。本论文提出构建转染复合体的原则为：静电自组装的转染复合体中，MNPs与PEI/pDNA复合体之间的结合力既要足够稳定能实现磁场力对转染复合体的操纵，又要使得MNPs与PEI/pDNA复合体在细胞内容易分离。磁转染机理的诠释及载体构建原则的提出，对于MNPs的表面修饰及磁转染载体的构建具有指导作用。关键词：磁性纳米粒子论文细胞相互作用论文细胞内吞论文基因转染论文磁转染论文胞饮作用论文吞噬作用论文表面修饰论文生物医学运用论文
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ABSTRACT6-13
第一章 绪论13-41

1.1 细胞对纳米材料内吞的探讨概述13-25

1.1 细胞内吞的概念及分类13-15

1.2 探讨细胞内吞纳米粒子的作用15-16

1.3 细胞内吞纳米粒子的探讨工具及策略16-18

1.4 影响纳米粒子内吞机制的因素18-20

1.5 纳米磁粒表面的不同修饰对细胞内吞的影响20-24

1.6 细胞对纳米材料内吞的总结24-25

1.2 非病毒载体基因转染的细胞障碍及构建对策25-35

1.2.1 基因转染介绍25-26

1.2.2 基因转移的细胞障碍26-29

1.2.3 不同非病毒载体的特点及构建对策29-34

1.2.4 非病毒载体构建的指导原则34-35

1.3 基于 PEI 的磁转染的机理及探讨概述35-38

1.3.1 PEI 转染的特点35-36

1.3.2 PEI/DNA 转染复合体在细胞内的命运36-37

1.3.3 PEI 在磁转染历程中的作用37-38

1.4 本论文的探讨目的、探讨内容及革新性38-41

第二章 SPC-A1 细胞对谷胱甘肽修饰的纳米磁粒（MNPs-GSSG）的内吞探讨41-50
引言41

2.1 实验部分41-44

2.

1.1 材料41-42

2.

1.2 MNPs-GSSG 的制备42

2.

1.3 MNPs-GSSG 的表征42

2.

1.4 MNPs-GSSG 的细胞毒性评价42-43

2.

1.5 MNPs-GSSG 在 SPC-A1 细胞内滞留量的定性浅析43

2.

1.6 SPC-A1 细胞对 MNPs-GSSG 的内吞动力学探讨43-44

2.2 结果与讨论44-49
2论文导读：6.4本章小结91-92第七章全文总结92-94参考文献94-106符号与标记（附录）106-107致谢107-111攻读博士学位期间已发表或录用的论文（附录Ⅱ）111-113上一页12
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2.1 MNPs-GSSG 的表征44-45

2.2 MNPs-GSSG 的细胞毒性评价45-46

2.3 MNPs-GSSG 在 SPC-A1 细胞中滞留量的定性浅析46-47

2.4 SPC-A1 对 MNPs-GSSG 的内吞动力学47-49

2.3 本章小结49-50

第三章 SPC-A1 及 WI-38 细胞对氨基硅烷纳米磁粒（MNPs-APTES）的内吞探讨50-56
引言50

3.1 材料与策略50-52

3.

1.1 材料与设备50

3.

1.2 MNPs-APTES 的制备50-51

3.

1.3 细胞培养51

3.

1.4 两种细胞在不同时间对磁粒内吞量的定量检测51-52

3.1.5 TEM 定性观察 SPC-A1 与 WI-38 对 MNPs-APTES 的内吞52
3.

1.6 SEM 观察 SPC-A1 及 WI-38 细胞表面形态52

3.

1.7 用 TEM 观察 MNPs-APTES 在 SPC-A1 细胞中的滞留52

3.2 结果与讨论52-55

3.3 本章小结55-56

第四章 SPC-A1 对 MNPs-GSSG 及 MNPs-APTES 内吞途径的探讨56-63
引言56

4.1 材料与策略56-58

4.

1.1 材料与表征仪器56-57

4.

1.2 MNPs-GSSG 及 MNPs-APTES 的制备及表征57

4.

1.3 定量检测内吞抑制剂对 SPC-A1 细胞内吞 MNPs 的影响57

4.1.4 TEM 观测内吞抑制剂对 SPC-A1 细胞内吞 MNPs 的影响57-58
4.

1.5 TEM 观测细胞对 MNPs 的内吞历程58

4.2 结果与讨论58-62
4.

2.1 TEM 检测 MNPs-GSSG 及 MNPs-APTES58

4.

2.2 内吞抑制剂对 SPC-A1 细胞内吞 MNPs 的影响58-60

4.

2.3 TEM 观察 SPC-A1 细胞对 MNPs 的内吞历程60-62

4.3 本章小结62-63
第五章 静电自组装三元复合体的磁转染的体外探讨63-76
引言63

5.1 材料与策略63-68

5.

1.1 材料与表征设备63-64

5.

1.2 带电 MNPs 的制备与表征64-66

5.

1.3 磁转染三元复合体的制备66-67

5.

1.4 细胞培养67

5.

1.5 MTT 毒性实验67

5.

1.6 磁转染67-68

5.2 结果与讨论68-75
5.

2.1 带电 MNPs 的表征68-69

5.

2.2 MTT 实验69-70

5.

2.3 基于 MNPs-PEI 的磁转染三元复合体增强 PEI 的转染70-71

5.

2.4 三种带电 MNPs 增强 PEI 的基因转染71-72

5.

2.5 三种带电 MNPs 提升脂质体的基因转染72-73

5.

2.6 磁转染的细胞系依赖性73-75

5.3 本章小结75-76
第六章 静电自组装磁转染复合体的转染机理探讨76-92
引言76-77

6.1 实验部分77-81

6.

1.1 材料及表征设备77-78

6.1.2 MNPs-PEI 以及磁转染复合体（Magnetofectins）的制备78
6.

1.3 琼脂糖凝胶电泳检测磁转染三元复合体的磁响应性及稳定性78-79

6.

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测磁转染三元复合体在酸性环境下的稳定性79

6.

1.5 细胞培养和磁转染流程79

6.

1.6 激光共聚焦显微镜观察复合体的细胞内途径79-80

6.

1.7 TEM 观察复合体的细胞内途径80

6.

1.8 磁转染复合体不同 N/P 比对转染结果的影响80-81

6.2 结果81-88
6.

2.1 MNPs-PEI 的表征81

6.

2.2 磁转染复合体的磁响应性以及在培养液中的稳定性81-83

6.

2.3 磁转染复合体在酸性环境中的稳定性83-85

6.

2.4 激光共聚焦显微镜观察磁转染复合体的细胞内吞途径85-86

6.

2.5 TEM 观察磁转染复合体的细胞内吞途径86-87

6.

2.6 磁转染复合体不同 N/P 比对转染结果的影响87-88

6.3 讨论88-91

6.4 本章小结91-92

第七章 全文总结92-94
参考文献94-106
符号与标记（附录）106-107
致谢107-111
攻读博士学位期间已发表或录用的论文（附录Ⅱ）111-113