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蛋白质工程,理性设计,木聚糖酶,同源建模,模拟突变,分子动力学,重叠延伸PCR,

最后更新时间:2024-02-27 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:17241 浏览:65617
论文导读:对策有两种:以定点突变为代表的理性设计和以定向进化为代表的非理性设计。理性设计是蛋白质改造的基本技术,其中,最关键的不足是弄清酶蛋白分子结构与功能之间的联系,有目标的选取突变位点对其进行改造。同时,突变位点的选择也是酶蛋白改造的关键选择,通常需要蛋白分子结构与功能相关方面的信息积累。但对于某些缺乏探讨积累
摘要:目的:蛋白质工程产生于20世纪80年代,其实施对策有两种:以定点突变为代表的理性设计和以定向进化为代表的非理性设计。理性设计是蛋白质改造的基本技术,其中,最关键的不足是弄清酶蛋白分子结构与功能之间的联系,有目标的选取突变位点对其进行改造。同时,突变位点的选择也是酶蛋白改造的关键选择,通常需要蛋白分子结构与功能相关方面的信息积累。但对于某些缺乏探讨积累的蛋白性质的改造,如蛋白分子的蛋白酶抗性改造,对于理性设计所需要的突变位点,通常无法用理性设计策略来获得,可以说这是一项十分有挑战性和重要运用价值的工作。饲料用酶是一类用量十分巨大的工业用酶,因其在加工利用历程中的特殊性,所以对酶的热稳定性、酸稳定性,蛋白酶抗性以及酶促反应的宽pH范围等都有较高的要求。饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的,在消化道中的蛋白酶对饲用酶的分解是影响饲用酶利用效率的重要理由,所以,具有蛋白酶抗性是饲用酶十分重要的性质。本探讨结合实验室已经建立的基于生物催化与计算化学的蛋白分子蛋白酶抗性理性设计的策略,进行Bacillus subtips168β-1,4-内切木聚糖酶胰蛋白酶抗性的改良,以获得胰蛋白酶抗性提升的改良酶,同时再次验证所建立的胰蛋白酶抗性理性改良策略的可行性。策略:(1)通过Discovery Studio3.0软件获得优化后的木聚糖酶的三维结构和结构中所有胰蛋白酶水解位点及暴露程度。(2)根据胰蛋白酶水解位点的暴露程度和通过比较突变效应能量值筛选出突变后结构与野生型相近或是比野生型还稳定的突变体。(3)对突变后的三维结构进行分子动力学模拟,计算表征结构稳定性的参数RMSD值,并且由动力学评价得到的三个突变体的最低能量构象与野生型最低能量构象进行结构相似性评价,进一步确证突变氨基酸的组合类型。(4)利用重叠延伸PCR定点突变技术对XynA野生型基因进行突变,PCR产物与@-@@a载体连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后,阳性克隆测序,验证正确的重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。(5)对纯化后的改良酶进行酶学性质浅析,并且将酶液经人工肠液(pH6.810mg/mL胰蛋白酶溶液)处理,浅析评价野生型及其突变体在胰蛋白酶溶液中的稳定性。结果:最终选取**、**进行单点突变,**/**进行两点突变,其中,位于酶蛋白内部的氨基酸位点**作为反证位点。对突变体及野生型进行酶学性质浅析发现,突变体与野生型的最适pH都是6.0,在pH4.0-9.0范围内,突变体XynA、XynA**和XynA**/**的pH稳定性比野生型更宽泛,XynA**的pH稳定性与野生型相似。XynA、 XynA**和XynA**/**的最适反应温度为60℃,在50℃以下较稳定,55℃时的半衰期是40min。XynA**的最适温度为40℃,与野生型相比也发生了转变。其温度稳定性较野生型差,当温度高于40℃时,酶失活的速度显著加速。XynA**在40℃以下较稳定,45℃时的半衰期是40min。在用人工肠液(pH6.810mg/mL胰蛋白酶溶液)处理野生型及其突变体的历程中发现,两点突变体XynA**/**和单点突变体XynA**的残留酶活力均显著比野生型XynA和内部对照突变体XynA**高。单点突变体XynA**的半衰期是193min,是野生型的1.52倍,两点突变体XynA**/**在人工肠液中的稳定性有了显著的提升,其半衰期是257min,是野生型XynA的2.02倍,是单点突变体XynA**的1.33倍。XynA**在人工肠液中40℃处理不同时间测活,XynA**在胰蛋白酶溶液中的半衰期为90min,仅比野生型酶缩短了37min。关键词:蛋白质工程论文理性设计论文木聚糖酶论文同源建模论文模拟突变论文分子动力学论文重叠延伸PCR论文
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Abstract5-8
英文缩略词表8-12
前言12-25

1.1 蛋白质工程介绍12-15

1.1 蛋白质工程的起源与目标12

1.2 蛋白质工程的探讨进展和运用前景12-14

1.3 蛋白质工程原理和基本操作14-15

1.2 同源建模、虚拟突变与分子动力学模拟15-20

1.2.1 蛋白质结构模拟15

1.2.2 同源建模15-17

1.2.3 虚拟突变17

1.2.4 分子动力学模拟17-20

1.3 基于生物催化与计算化学的蛋白分子蛋白酶抗性的理性设计20

1.4 胰蛋白酶及其催化机制20-21

1.5 木聚糖酶的介绍和蛋白质工程21-24

1.5.1 木聚糖及木聚糖酶的介绍21-23

1.5.2 木聚糖酶的蛋白质工程23-24

1.6 探讨背景、作用和实验流程24-25

第二章 实验设备、试剂及材料25-29

2.1 主要仪器设备25-26

2.2 实验材料26-29

2.1 菌种及载体26

2.2 培养基和常用试剂26-28

2.3 酶类28

2.4 试剂盒28

2.5 其它28-29

第三章 实验策略29-42

3.1 胰蛋白酶抗性的理性设计29-30

3.1.1 B.subtips 168 β-1,4-内切木聚糖酶 XynA 三维模型的构建29
3.

1.2 胰蛋白酶水解位点的查找29

3.

1.3 候选突变氨基酸残基的确定29

3.

1.4 更替氨基酸的选择和突变氨基酸组合类型的确定29-30

3.2 野生型木聚糖酶 XynA 重组菌的构建及重组子的鉴定30-32
3.

2.1 Bacillus subtips 168 基因组的提取[63]30

3.

2.2 XynA 全长基因的扩增30-31

3.

2.3 @@@a-XynA 重组质粒的构建及转化31-32

3.3 BL21(DE3)-@@@a-XynA 诱导表达和酶学性质浅析32-35

3.1 XynA 诱导表达条件的探讨32

3.3.2 SDS-PAGE论文导读:构建和转化40-413.9BL21(DE3)-@@@a-XynA**的诱导表达和酶学性质的浅析41-423.9.1突变体XynA**重组质粒转化BL21(DE3)诱导表达413.9.2XynA**的纯化、浅析与鉴定413.9.3突变体XynA**酶学性质浅析41-42第四章实验结果42-504.1胰蛋白酶抗性的理性设计42-434.

1.1B.subtips168β-1,4-内切木聚糖酶XynA三维模型的构建

检测表达产物32-33

3.3 XynA 的诱导表达33

3.4 XynA 的纯化、浅析和鉴定33-34

3.5 XynA 酶学性质浅析34-35

3.4 单点突变体 XynA**重组菌的构建和重组子的鉴定35-36

3.4.1 单点突变(**)引物设计35

3.4.2 重叠延伸 PCR (over-lap PCR) 法定点突变35

3.4.3 XynA**全长基因的获得35

3.4.4 PCR 产物纯化回收35

3.4.5 @@@a-XynA**重组质粒的构建及转化35-36

3.5 BL21(DE3)-@@@a-XynA**的诱导表达和酶学性质的浅析36-37

3.5.1 单点突变体重组质粒转化 BL21(DE3)诱导表达36

3.5.2 XynA**的纯化、浅析与鉴定36-37

3.5.3 XynA**酶学性质浅析37

3.6 两点组合突变体 XynA**/**重组菌的构建和重组子的鉴定37-39

3.6.1 两点组合突变(**/**)引物的设计37

3.6.2 重叠延伸 PCR (over-lap PCR) 法定点突变37

3.6.3 XynA**/**全长基因的获得37-38

3.6.4 PCR 产物纯化回收38

3.6.5 @@@a-XynA**/**重组质粒的构建及转化38-39

3.7 BL21(DE3)-@@@a-XynA**/**的诱导表达和酶学性质的浅析39

3.7.1 两点突变体重组质粒转化 BL21(DE3)诱导表达39

3.7.2 XynA**/**的纯化、浅析与鉴定39

3.7.3 XynA**/**酶学性质浅析39

3.8 突变体 XynA**重组菌的构建和重组子的鉴定39-41

3.8.1 突变(**)引物的设计39-40

3.8.2 重叠延伸 PCR (over-lap PCR) 法定点突变40

3.8.3 XynA**全长基因的获得40

3.8.4 PCR 产物纯化回收40

3.8.5 @@@a-XynA**重组质粒的构建和转化40-41

3.9 BL21(DE3)-@@@a-XynA**的诱导表达和酶学性质的浅析41-42

3.9.1 突变体 XynA**重组质粒转化 BL21(DE3)诱导表达41

3.9.2 XynA**的纯化、浅析与鉴定41

3.9.3 突变体 XynA**酶学性质浅析41-42

第四章 实验结果42-50

4.1 胰蛋白酶抗性的理性设计42-43

4.1.1 B.subtips 168 β-1,4-内切木聚糖酶 XynA 三维模型的构建42
4.

1.2 木聚糖酶 XynA 候选突变位点的选择和突变类型的确定42

4.

1.3 模拟突变和选择突变体42-43

4.

1.4 分子动力学模拟评价突变体的稳定性43

4.

1.5 野生型与突变型的结构比对43

4.2 野生型 XynA 重组菌的构建及蛋白诱导表达纯化43-45
4.

2.1 基因组 DNA 的提取43

4.

2.2 PCR 获得野生型全长基因43-44

4.

2.3 重组子 pMD18-T-XynA 鉴定及序列测定44

4.

2.4 重组子@@@a-XynA 的鉴定及测序44-45

4.

2.5 XynA 诱导表达条件的探讨45

4.

2.6 XynA 的纯化45

4.3 单点突变体 XynA**重组菌的构建和蛋白诱导表达纯化45-46
4.

3.1 重叠延伸 PCR 获得单点突变体突变基因45

4.

3.2 重组子@@@a-XynA**的鉴定及测序45-46

4.

3.3 改良酶 XynA**的纯化46

4.4 组合突变体 XynA**/**重组菌的构建和蛋白诱导表达纯化46-47

4.1 重叠延伸 PCR 获得两点组合突变体突变基因46

4.2 重组子@@@a-XynA**/**的鉴定及测序46

4.3 改良酶 XynA**/**的纯化46-47

4.5 突变体 XynA**重组菌的构建和蛋白诱导表达纯化47

4.5.1 重叠延伸 PCR 获得单点突变体突变基因47

4.5.2 重组子@@@a-XynA**的鉴定及测序47

4.5.3 改良酶 XynA**的纯化47

4.6 野生型及突变体酶学性质浅析47-50

4.6.1 最适 pH47-48

4.6.2 最适温度48

4.6.3 pH 稳定性48

4.6.4 温度稳定性48

4.6.5 野生型及突变体在胰蛋白酶溶液中的稳定性48-49

4.6.6 储藏稳定性49-50

第五章 讨论50-54

5.1 理性设计中突变位点的选择和突变体组合类型的确定50

5.

1.1 突变位点的选择50

5.

1.2 突变体组合类型的确定50

5.2 突变类型与突变体的性质50-52
5.

2.1 单点突变50-51

5.

2.2 两点联合突变51

5.

2.3 内部对照突变51-52

5.3 重叠延伸 PCR 定点突变52

5.4 酶的诱导表达与纯化52-54

总结与展望54-55
参考文献55-61
攻读硕士学位期间发表论文及获奖情况61-62
致谢62-63
特别致谢63