肺炎克雷伯氏菌,全局转录机器工程,醛脱氢酶,同源重组,3-羟基丙酸,发酵,

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摘要：3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）是一种重要的平台C3化合物，利用微生物生产3-HP是目前探讨的热点。本论文以高效利用甘油的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）为宿主菌，采取分子生物学手段，以以下三个方面构建了3-HP的高产菌株，并对高产菌株生产3-HP进行了初步探讨。1、本探讨首次采取全局转录机器工程（gTME）的对策，利用易错PCR技术构建K.pneumoniae关键元件首要σ因子基因rpoD的突变文库，连接至表达载体pET-PK，电转化K.pneumoniae D2026，以大量阳性克隆中筛选出一株3-HP高产菌K.p(pET-PK-mrpoD)。初步发酵试验表明，该携带突变rpoD基因的重组菌能高效利用甘油生产3-HP，产量达到4.49g/L，比携带野生型rpoD基因的对照菌提升242.75%，甘油转化率、生产强度分别提升了832.50%、239.39%。2、本探讨克隆了来自于大肠杆菌（Escherichia cop）的醛脱氢酶基因aldH，连接至表达载体pET-PK，电转化K.pneumoniae D2026，得到重组菌K.p(pET-PK-aldH)。试验表明，基因aldH成功表达，K.p(pET-PK-aldH)的3-HP产量达到2.96g/L，比对照菌K. p (pET-PK)提升了1.5倍，生产强度提升57.36%。3、本探讨首次采取同源重组对策，设计了以基因aldH为核心的同源重组片段，利用K.pneumoniae自身的RecA同源重组系统，将同源重组片段转换到K.pneumoniae染色体的IS1位置，构建了重组菌KpAD。试验表明，转换至染色体上的基因aldH成功表达，KpAD/Kan~+的3-HP产量达到0.84g/L，KpAD/Kan-的3-HP产量达到了0.90g/L，分别是对照菌产量0.60g/L的1.4、1.5倍，KpAD/Kan-的甘油转化率、生产强度是对照菌的1.7、1.5倍，KpAD/Kan+的甘油转化率、生产强度是对照菌的2、1.4倍。关键词：肺炎克雷伯氏菌论文全局转录机器工程论文醛脱氢酶论文同源重组论文3-羟基丙酸论文发酵论文
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ABSTRACT6-16
第一章 绪论16-26

1.1 3-羟基丙酸概况16-20

1.1 3-羟基丙酸的理化性质及用途16-17

1.2 3-羟基丙酸的合成策略17

1.3 生物法生产 3-羟基丙酸的途径17-19

1.4 生产菌株19-20

1.2 全局转录调控机器工程20-22

1.2.1 原理20-21

1.2.2 全局转录调控在改善细胞表型中的运用和优势21-22

1.3 同源重组技术与 RecA 重组系统22-24

1.3.1 同源重组技术22-23

1.3.2 RecA 重组系统23-24

1.4 插入序列24-25

1.5 本课题的探讨作用25-26

第二章 全局转录调控法生产 3-羟基丙酸的探讨26-42

2.1 引言26

2.2 实验材料26-27

2.1 菌株与质粒26

2.2 试剂与仪器26-27

2.3 培养基27

2.3 实验策略27-34

2.3.1 K.pneumoniae 基因组总 DNA 的提取27-28

2.3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增 K.pneumoniae 的首要σ因子基因 rpoD28
2.3.3 构建含有未突变基因 rpoD 的表达载体 pET-PK-wrpoD28-29

2.3.4 阳性克隆 E.cop(pET-PK-wrpoD)的鉴定29-30

2.3.5 对照菌 K.p(pET-PK-wrpoD)的构建30-31

2.3.6 易错 PCR 扩增基因 rpoD31

2.3.7 构建基因 rpoD 突变库31-32

2.3.8 工程菌 K.p(pET-PK-mrpoD)的鉴定32

2.3.9 工程菌 K.p(pET-PK-mrpoD)的发酵32-33

2.3.10 生长曲线的绘制和底物甘油消耗的测定33

2.3.11 高效液相色谱（HPLC）检测发酵液中产物 3-HP 的产量33

2.3.12 高产工程菌突变基因 rpoD 的测序鉴定33-34

2.4 结果与讨论34-40

2.4.1 K.pneumoniae 基因组总 DNA 的提取34

2.4.2 PCR 扩增 K.pneumoniae 的首要σ因子基因 rpoD34-35

2.4.3 阳性克隆 E.cop（pET-PK-wrpoD）的鉴定35-36

2.4.4 对照菌 K.p(pET-PK-wrpoD)的构建36

2.4.5 易错 PCR 扩增基因 rpoD 的最优条件和突变库的构建36-37

2.4.6 重组菌 K.p(pET-PK-mrpoD)阳性克隆的筛选37-38

2.4.7 重组菌 K.p(pET-PK-mrpoD)发酵生产 3-HP38-40

2.4.8 突变 rpoD 基因的序列浅析40

2.5 本章小结40-42

第三章 E.cop 醛脱氢酶（aldH）的克隆与表达42-54

3.1 引言42

3.2 实验材料42-43

3.

2.1 菌株与质粒42

3.

2.2 试剂与仪器42

3.

2.3 培养基42-43

3.3 实验策略43-46

3.1 E.cop 基因组总 DNA 的提取43

3.2 E.cop 醛脱氢酶基因 aldH 的克隆43-44

3.3 构建表达载体 pET-PK-aldH44-45

3.4 阳性克隆 E.cop(pET-PK-aldH)的鉴定45

3.5 工程菌 K.p(pET-PK-aldH)的构建45

3.6 醛脱氢酶基因 aldH 在 K.pneumoniae 中的表达45-46

3.3.7 重组菌 K.p(pET-PK- aldH)发酵生产 3-论文导读：C检测发酵液中产物3-HP的产量463.4结果与讨论46-523.4.1E.cop基因组总DNA的提取46-473.4.2PCR扩增E.cop的醛脱氢酶基因aldH473.4.3表达载体pET-PK-aldH的鉴定47-483.4.4重组菌K.p(pET-PK-aldH)的构建48-493.4.5醛脱氢酶基因aldH在K.pneumoniae中的表达49-503.4.6重组菌K.p(pET-PK-aldH)发酵生产3-
HP46

3.8 生长曲线的绘制和底物甘油消耗的测定46

3.9 HPLC 检测发酵液中产物 3-HP 的产量46

3.4 结果与讨论46-52

3.4.1 E.cop 基因组总 DNA 的提取46-47

3.4.2 PCR 扩增 E.cop 的醛脱氢酶基因 aldH47

3.4.3 表达载体 pET-PK-aldH 的鉴定47-48

3.4.4 重组菌 K.p(pET-PK-aldH)的构建48-49

3.4.5 醛脱氢酶基因 aldH 在 K.pneumoniae 中的表达49-50

3.4.6 重组菌 K.p(pET-PK-aldH)发酵生产 3-HP50-52

3.5 本章小结52-54

第四章 同源重组对策生产 3-羟基丙酸的探讨54-70

4.1 引言54

4.2 实验材料54-55

4.

2.1 菌株与质粒54

4.

2.2 试剂与仪器54

4.

2.3 培养基54-55

4.3 实验策略55-61
4.

3.1 同源重组片段的设计55

4.

3.2 AD 各组成部分的克隆55-57

4.

3.3 overlap PCR 克隆片段 AB、CD57-58

4.

3.4 重组质粒 pET-AB 的构建58-59

4.

3.5 重组质粒 pET-AD 的构建59-60

4.

3.6 同源重组构建重组菌 KpAD60

4.

3.7 重组菌 KpAD 的蛋白表达60-61

4.

3.8 重组菌 KpAD 发酵生产 3-HP61

4.4 结果与讨论61-69

4.1 PCR 扩增 AD 各组成部分61-62

4.2 overlap PCR 扩增 AB、CD62

4.3 重组质粒 pET-AB 的鉴定62-63

4.4 重组质粒 pET-AD 的鉴定63-64

4.5 PCR 扩增同源重组片段 AD64-65

4.6 重组菌 KpAD 的鉴定65-66

4.7 重组菌 KpAD 的蛋白表达66-67

4.8 重组菌 KpAD 发酵生产 3-HP67-69

4.5 本章小结69-70

第五章 总结与倡议70-74

5.1 结论70-71

5.2 革新点71

5.3 不足与倡议71-74

参考文献74-80
附录 1 试剂80-82
附录 2 仪器82-83
致谢83-84
探讨成果及发表的学术论文84-85
作者和导师介绍85-86
硕士探讨生学位论文答辩委员会决议书86-87