苯乳酸,苯丙酮酸,副干酪乳杆菌,乳酸脱氢酶,生物信息学,分子克隆,诱导表达,

论文导读：
摘要：苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)是一种新型生物防腐剂，乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase, LDH)是乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)中转化苯丙酮酸(phenypyrubvate, PPA)生成苯乳酸的主要酶。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）和瑞士生物信息学探讨所的蛋白浅析专家系统（ExPASY）中有关基因和蛋白的序列和结构信息浅析的各种工具，结合其他生物信息学浅析软件，如ClustalX、VMD等，以数据库中得到副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶基因，浅析、预测该基因编码的蛋白理化性质、翻译后的修饰位点、拓扑结构、二级结构、结构和功能域。并与其他微生物的乳酸脱氢酶蛋白序列进行比对，得出它们的保守序列。得出该基因编码335个氨基酸，其蛋白论述分子质量为36608.8，预测该蛋白有三个跨膜区。与干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶进化联系最近。运用生物信息策略预测得到副干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶的结构与功能方面的信息，为我们进一步开展本实验室副干酪乳杆菌W2（LactobacillusparacaseiW2）的LDH有关探讨提供了论述依据，同时对我们以后克隆表达有活性的LDH蛋白提供帮助。以副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）基因组DNA为模板，根据GeneBank中已公布的副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶基因ldh序列设计引物，PCR扩增乳酸脱氢酶(ldh)基因并连接到pMD19-T简易载体中。测序结果表明：副干酪乳杆菌W2基因长度为1008bp。与GeneBank中L.paracasei subsp. Paracasei的LDH蛋白基因序列同源性为99.6%，氨基酸序列同源性100%，说明ldh基因在副干酪乳杆菌中是非常保守的。将双酶切后的目的基因与pET-22b(+)连接，构建成重组质粒pET22b-ldh导入E. copBL21(DE3)感受态细胞中诱导表达目的蛋白LDH。经SDS-PAGE浅析可见约37kD的与预期大小一致的目的蛋白条带，酶活浅析产物的粗提液酶活力为74.5U/mL，表明ldh基因表达产物具有生物活性。LDH最适温度为50℃，最适pH为6.0，热稳定性较好。LDH对苯丙酮酸的Km为2.512mM。关键词：苯乳酸论文苯丙酮酸论文副干酪乳杆菌论文乳酸脱氢酶论文生物信息学论文分子克隆论文诱导表达论文
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Abstract6-11
第一章 绪论11-19

1.1 苯乳酸的介绍11-14

1.1 苯乳酸的结构与性质11

1.2 苯乳酸的抑菌谱11-12

1.3 苯乳酸的安全性12

1.4 苯乳酸的化学合成12

1.5 苯乳酸的生物合成12-13

1.6 苯乳酸的运用13-14

1.2 乳酸脱氢酶的来源和探讨近况14-16

1.2.1 乳酸脱氢酶介绍14-15

1.2.2 乳酸脱氢酶的来源15-16

1.2.3 乳酸菌中对苯丙酮酸有活性的乳酸脱氢酶探讨16

1.2.4 乳酸脱氢酶基因的探讨进展16

1.3 乳酸脱氢酶的基因工程16-17

1.4 生物信息学17-18

1.5 本课题的探讨作用及内容18-19

1.5.1 探讨作用18

1.5.2 探讨内容18-19

第二章 副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶的生物信息学浅析19-26

2.1 前言19

2.2 材料与策略19-20

2.1 材料19

2.2 策略19-20

2.3 结果20-24

2.3.1 Blast 的浅析结果20

2.3.2 LDH 蛋白的理化性质20-21

2.3.3 ldh 翻译后的修饰位点、亚细胞定位的预测21

2.3.4 LDH 的拓扑结构和二级结构浅析21

2.3.5 L.paracasei 的 LDH 的模拟三维结构21-22

2.3.6 副干酪乳杆菌 LDH 与其他物种 LDH 的比较和分子进化的构建22-24

2.4 小结24-26

第三章 副干酪乳杆菌 ldh 基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达26-40

3.1 前言26

3.2 材料26-30

3.

2.1 菌种与质粒26

3.

2.2 培养基26-27

3.

2.3 工具酶27

3.

2.4 试剂27

3.

2.5 主要试剂配制27-29

3.

2.6 主要仪器与设备29-30

3.3 策略30-35

3.1 乳酸脱氢酶基因引物的设计30

3.2 L.paracasei 基因组 DNA 的提取30-31

3.3 PCR 扩增 ldh 基因31-34

3.4 原核表达载体的构建34-35

3.4 结果35-38

3.4.1 副干酪乳杆菌 ldh 基因的 PCR 扩增35-36

3.4.2 克隆载体 pMD19-ldh 的构建36-37

3.4.3 表达载体的构建37

3.4.4 重组乳酸脱氢酶的表达37-38

3.4.5 酶活力测定38

3.5 小结38-40

第四章 重组乳酸脱氢酶的酶学性质探讨40-49

4.1 前言40

4.2 仪器与试剂40-41

4.

2.1 仪器40-41

4.

2.2 试剂41

4.

2.3 主要试剂配制41

4.3 策略41-42
4.

3.1 LDH 粗酶液的提取41

4.

3.2 温度对 LDH 酶活性的影响41-42

4.

3.3 温度对 LDH 稳定性的影响42

4.

3.4 不同 pH 对 LDH 酶活性的影响42

4.

3.5 不同金属离子对 LDH 酶活性的影响42

4.

3.6 重组 LDH 酶的米氏常数 Km 的测定42

4.4 结果42-47

4.1 温度对 LDH 酶活性的影响42-43

4.2 温度对 LDH 稳定性的影响43-44

4.3 不同 pH 对 LDH 酶活性的影响44

4.4 不同金属离子对 LDH 酶活性的影响44-45

4.5 重组 LDH 对 NADH 和苯丙酮酸的米氏常数 Km45-47

4.5论文导读：小结47-49总结与展望49-51参考文献51-59攻读学位论文期间本人出版或公开发表的论著、论文59-60致谢60-61上一页12
小结47-49
总结与展望49-51
参考文献51-59
攻读学位论文期间本人出版或公开发表的论著、论文59-60
致谢60-61