浅谈转基因大米中科丰6号和克螟稻检测

论文导读：lt="转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测研究"/>摘要：本研究采用实时荧光定量PCR技术，建立了转科丰6号和克螟稻基因大米成分的快速检测策略。根据国内外文献查阅的科丰6号和克螟稻引物信息，确立了转科丰6号和克螟稻基因大米快速检测策略，并对其特异性、灵敏度和PCR扩增效率进行了验证。结果表明本研究建立的策略具有良好的特
img src="www.7ctime.com/UploadFiles/2014-02/2/20142147854774498.jpg" alt="转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测研究" />摘要：本研究采用实时荧光定量PCR技术，建立了转科丰6号和克螟稻基因大米成分的快速检测策略。根据国内外文献查阅的科丰6号和克螟稻引物信息，确立了转科丰6号和克螟稻基因大米快速检测策略，并对其特异性、灵敏度和PCR扩增效率进行了验证。结果表明本研究建立的策略具有良好的特异性和PCR扩增效率，灵敏度可达到0.01%。
关键词：转基因大米 科丰6号 克螟稻 检测
1672-5336（2013）18-0012-04
由于转基因作物种植面积的不断扩展，转基因作物不但广泛进入食品市场，而且已成为饲料行业的主要原料来源[1]。然而，基因工程掌握的不确定性及不可预测性，使得转基因食品安全理由成为目前人类在发展过程中必须面对的一个棘手的环境理由[2]。各国政府纷纷出台了一系列有关转基因及其产品的管理、规定和法规，要求对转基因及其产品进行标注，标明其是否为转基因，让消费者选择[3]。2002年我国农业部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》，规定对5大类17种产品必须进行标识[4]。
大米是我国主粮，我国一直在进行转基因水稻研究，但一直没批准转基因水稻商业化种植。多年来我国出口大米及其制品一直受到转基因理由困扰，严重影响我国出口大米及其制品正常贸易[5-6]。2011年12月23日，欧盟公报发布了2011/884/EU号执行决议替代2008/289/EC号决议，将措施管辖的范围扩展到所有在中国米产品中发现的转基因品系，对中国米产品实施史上最为严苛的入境检查。因此，应用转基因大米快速灵敏的检测策略有组织、有针对性的开展对转基因大米样品的检测和监控显的愈发重要，为有关部门提供监管和行政执法的科学依据、帮助食品出口企业突破贸易壁垒等都具有十分重要的作用。
1 材料和策略

1.1 仪器

高速冷冻离心机3K18型，德国Sigma公司；超纯水处理器Milli-Qplus，法国产；梯度PCR仪MyCyclerTM，美国Bio-RAD公司；电泳仪POWER Pac300，美国Bio-RAD公司；凝胶电泳图像分析系统2000型，美国Bio-RAD公司；恒温摇床，Orbital shaker，Thermo 转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测相关论文由www.7ctime.com收集,如需论文.Forma，美国产；7500Fast实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司。

1.2 材料和试剂

CTAB提取缓冲液（20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，20mmol/L NaR2REDTA，pH8.0）；CTAB沉淀缓冲液（5g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl）；TE缓冲液：Tris 0.01mol/L，Na2EDTA0.001mol/L，用HCl或NaOH调节pH至8.0；稀释液：Waters-DEPC treated，上海生工；蛋白酶K：20mg/mL；NaCl溶液，1.2mol/L；无水乙醇、氯仿、异丙醇等有机试剂；荧光定量PCR试剂盒：TaKaRa Premix Ex Taq2×；样品来源：本实验室检测留样。待测式样见表1，由中国检验检疫科学研究院提供。

1.3 引物

根据国内外文献查阅的KF6（科丰6号）和KMD（克螟稻）的引物信息[7-8]，见表2。

1.4 检测步骤

1.4.1 样品制备

（1）取一定重量的检验样品，具体重量按照相关标准执行[7-19]，放到干燥洁净的研磨器中充分研磨约10分钟，样品呈粉末状为佳。
*研磨器不能连续运转超过1分钟，中间需暂停，取出转子摇匀样品，再研磨。
（2）取大约1g研磨好呈粉末状的其他样品加入到15ml离心管中，做好标记，另取约1g阴性样品作为提取对照。
*取样尽量取最细的。

1.4.2 DNA提取

（1）在制备好的样品中加入5mL CTAB提取缓冲液（可加20μL蛋白酶K溶液，水浴65℃孵化1h（检查样品材料是否膨胀，样品应只有悬浮在液体中，如材料膨胀，再加入CTAB提取缓冲液，每次1mL）。
（2）孵育过夜。
（3）常温离心12000rpm，10min直至悬浮部分几近清澈（注意不能使用冷冻，因为冷冻使部分DNA沉淀）。
（4）将1mL的上清液转入2mL的离心管中，加入700μL氯仿，高速涡旋震荡混合30s。
（5）常温12000rpm，10min，收集600-650μL上清，转移到一个新的2mL离心管，加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液。
（6）室温（20℃～24℃）孵化60min，12000rpm离心10min。弃上清，将沉淀溶于350μL，

1.2mol/L NaCl溶液。加入350μL氯仿，高速涡旋震荡30s，混匀。

（7）12000rpm离心15min，小心将上清转移至新的反应管中，加入0.8倍体积的异丙醇，室温（20℃～24℃）孵化至少20min。
（8）12000rpm离心10min，弃上清。加入500μL，70%乙醇洗涤沉淀，小心高速涡旋震荡约30s，12000rpm离心10min。
（9）弃上清，使沉淀干燥。（最好室温条件下过夜；或60 ℃以下15 min～20 min，不能让沉淀过干）。
（10）将DNA溶于100μL TE缓冲液中，4℃保存备用。

1.4.3 PCR反应

（1）阴性对照、阳性对照和空白对照的设置。阴性对照以待测非转基因食品的DNA为模板。阳性对照以采用含有待测基因序列的植物的DNA为模板，或采用含有待测基因序列的质粒。空白对照分别设DNA提取空白对照（以水或TE代替样品）和PCR反应的空白对照（以水或TE代替DNA模板）。 全文地址：www.7ctime.com/zxskjlw/lw4096.html上一论文：简论中医药高校生科研能力的培养