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关于荆芥防风药对HPLC特征图谱

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论文导读:图数据依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件,以130616-2号样品色谱图为指定参照图谱(对照图谱生成策略采用平均数法,时间窗宽度为0.10),多点校正和自动匹配后,得到11批该药对的相似度数据,特征图谱及对照特征图谱,结果见表2,图1,123下一页
[摘要] 该实验采用高效液相色谱法,Agilent Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相0.5‰三氟乙酸-乙腈,梯度洗脱,建立了不同产地及批号的荆芥防风药对的特征图谱,标定了12个共有特征峰,并得到了荆芥防风药对的对照特征图谱。该法简便,准确,重复性好,可作为该药对的质量制约依据之一。
[关键词] 荆芥;防风;药对;特征图谱
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分,味辛,性温,入肺、肝经,具有解表散风、透疹、消疮之功效。防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.的干燥根,味辛、甘,性微温,入膀胱、肝、脾经,具有祛风解表、胜湿止痛、止痉之功效[1]。中医古方荆防散,由荆芥、防风组成,名曰荆防散。《本草求真》曰:“荆芥……不似防风气不轻扬,驱风之必入人骨肉也,是以宜散风邪,用以防风之必兼用荆芥者,以其能入肌肤宣散故耳”。二者配为药对,相须为用,并走于上,发散风寒,祛风胜湿之力增强,然发汗力较缓,常用于外感风寒、发热恶寒、头痛身痛[2-3],临床极为常用。临床上单独使用荆防散或以此为君药的方剂,如消风散、驱风一字散等用于治疗风邪所致的疾病,如瘙痒风疹、风盛目痒等[4-5];也有研究者以荆芥、防风为方,采用现剂工艺制得荆防抗感泡腾片,用于流感病毒的治疗中[6]。现代药理研究证明,该药对具有相似的药理作用,两者均有解热、镇痛、镇静、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗惊厥、增强免疫功能的作用[7-10]。然而对于该药对的质量制约尚未见报道,本实验采用高效液相色谱法[11],运用特征图谱技术对荆芥防风药对进行质量制约,以期保证临床用药疗效。
1 材料
Waters 2695高效液相色谱系统;Waters Empower Pro 色谱工作站(美国沃特斯公司);赛多利斯电子天平(d=0.01 mg,BP211D,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);FA1104N电子天平(d=0.1 mg,上海精密科学仪器有限公司);KQ-500B超声清洗仪;高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);优普特实验室超纯水器。
升麻素苷,5-O-维斯拉米醇苷(南京泽朗植提医药科技有限公司,规格均为98%);橙皮苷(中国食品药品检定研究院,批号110721-200211,供含量测定用);胡薄荷酮[R-(+)-pulegone,98%,Sigma-Aldrich 公司];乙腈(色谱纯,河北杜克化学科技有限公司);三氟乙酸(色谱级,Aladdin Chemistry公司);甲醇(色谱纯,江苏汉邦科技有限公司);超纯水。
荆芥、防风样品各11批,分别打粉,过2号筛。产地、批号及两两配伍编号见表1。
2 策略与结果

2.1 供试品溶液的制备

取荆芥、防风粉末各1 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,加甲醇20 mL,超声处理30 min,取出,放冷,滤过,加甲醇适量洗涤2次,合并滤液和洗液,转移至25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。
2荆芥防风药对的HPLC特征图谱由专注毕业论文与职称论文的www.7ctime.com提供,转载请保留..2 对照品溶液的制备
精密称定升麻素苷1.30 mg和5-O-维斯拉米醇苷1.54 mg,分别置10 mL量瓶中,用0.5‰三氟乙酸-乙腈混合液(1∶1)溶解至刻度,摇匀,即得;精密称定橙皮苷1.55 mg和胡薄荷酮1.78 mg,分别置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 色谱条件

Agilent Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相0.5‰三氟乙酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,0~40 min,95%~60% A;40~60 min,60%~40% A;60~61 min,40%~95% A;61~65 min,95% A。体积流量

1.0 mL·min-1;柱温30 ℃;检测波长280 nm;进样量10 μL。

2.4 策略学考察

2.4.1 精密度试验 取编号为130616-1的供试品溶液,按上述色谱条件连续进样6针,每次进样10 μL,记录各共有峰的保留时间和峰面积。以4号峰的保留时间和峰面积为参照,计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积及RSD。相对保留时间的RSD均在0.030%~

1.3%,相对峰面积的RSD均在0.99%~2.8%,证明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 按2.1项下所述策略平行制备编号为130616-1的供试样品溶液6份,分别进样,每次进样10 μL,记录各共有峰的保留时间和峰面积。以4号峰的保留时间和峰面积为参照,计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积及RSD。相对保留时间的RSD均在0.020%~0.84%,相对峰面积的RSD均在

1.0%~4.3%,证明其重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取130616-1号供试品溶液,按上述色谱条件分别于0,1,2,4,6,9,12,18 h各进一针,共8次,每次进样10 μL,记录各共有峰的保留时间和峰面积。以4号峰的保留时间和峰面积为参照,计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积及RSD。相对保留时间的RSD均在0.040%~1.2%,相对峰面积的RSD均在0.64%~

3.9%,证明供试品溶液在18 h内稳定。

2.5 荆芥防风药对特征图谱的相似度评价及对照特征图谱的建立

取11批荆芥防风的混合供试品粉末,按上述供试品制备策略制备供试品溶液,依法检测。将所得的色谱图数据依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件,以130616-2号样品色谱图为指定参照图谱(对照图谱生成策略采用平均数法,时间窗宽度为0.10),多点校正和自动匹配后,得到11批该药对的相似度数据,特征图谱及对照特征图谱,结果见表2,图1,论文导读:制约中药的质量,对于提高中药质量,推动中药现代化具有重要作用。但由于同种药材的产地、采收期不尽相同,加之不同制药企业对同种药材加工工艺各异,如果同一种中药确定同一个“指纹图谱”来制约,有相当的难度。因此,采取“特征图谱”的策略来制约中药质量,只对主要共有特征峰的相对保留时间作出规定,忽略相对峰面积及峰面积较
2。

2.6 共有特征峰的标定

根据HPLC测定结果结合相似度计算以及匹配结果,选出具有代表性的12个峰作为共有特征峰,依次编号为1~12。参照2010年版《中国药典》中中药特征图谱研究规定,供试品特征图谱中应呈现12个特征峰,其中2,3,4,5,6,12号峰应分别与相应的参照物峰保留时间一致;与4号峰(5-O-维斯拉米醇苷)参照峰相应的峰为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内。选择相对保留时间的平均值作为规定值:0.141 5(峰1),0.758 3(峰2),0.936 6(峰3),1.000 0(峰4),1.071 2(峰5),1.147 0(峰6),1.260 5(峰7),1.312 7(峰8),1.354 1(峰9),1.506 6(峰10),

2.000 7(峰11),354 9(峰12)。

2.7 检测波长的选择

本实验通过UV检测器对样品在210~400 nm进行扫描,经过综合比较信号强度、峰数,选定280 nm为本实验制作特征图谱的测定波长。

2.8 参照物的选择及共有峰的归属

通过与对照品图谱比对,检定出编号为2,4,5,12的色谱峰分别为升麻素苷、5-O-维斯拉米醇苷、橙皮苷、胡薄荷酮。其中升麻素苷、5-O-维斯拉米醇苷为防风中的化学成分,橙皮苷、胡薄荷酮为荆芥中的化学成分。本实验选取4号峰(5-O-维斯拉米醇苷)为参照物。另外,通过与单个药材荆芥、防风在该测定条件下色谱图的比较,可以得出编号为5~8,10,11的共有峰为荆芥中的化学成分;编号为2~4,9的共有峰为防风中的化学成分。
3 讨论
“药对”又称“对药”、“对子”,是指临床上常用且相对固定的2味中药的配伍组合,是方剂最小的组方单位,是连接中药和方剂的桥梁。“药对”之名在《神农本草经》中虽未直接提出,但已有“药有阴阳配合,子母兄弟”及“七情和合”等配伍理论的记载。应用现代科学技术从多角度、多层面对药对进行组成结构、配伍效应、物质基础、作用机制、代谢过程以及量效关系等方面的关联研究,揭示其科学内涵和配伍规律,不仅有利于理解药对配伍理论“七情和合”的组成规律,更有利于提高中医临床用方用药的安全性和有效性,以指导临床合理用药。荆芥防风药对应用于临床,其荆芥发汗散寒之力较强,防风祛风之功较胜,既能散风寒,又能祛风热,四时感冒皆可使用[12],二者作为药对广泛应用于临床。
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于中药材、提取物或复方制剂的真伪鉴别及成品质量的一致性评荆芥防风药对的HPLC特征图谱相关论文由www.7ctime.com收集,如需论文.价。中药指纹图谱是在固定中药材品种、产地和采收期的前提下,制定的必须符合国家药品食品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定的指纹图谱。其评价依据是通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》计算出来的相似度,该相似度除要求保留时间的相似外,还对中药材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值做了进一步的要求,其规定单峰面积占总峰面积大于或等于20%的共有峰,其差值不得大于±20%;单峰面积占总峰面积大于或等于±10%,而小于20%的共有峰,其差值不得大于±25%;单峰面积占总峰面积小于10%的共有峰,峰面积比值不作要求,但必须标定相对保留时间;且要求供试品图谱中,非共有峰总面积不得大于总峰面积的10%,因此指纹图谱是一种半定量的中药质量制约策略。中药特征图谱是按照指纹图谱策略和原理建立的,是指通过不同来源的10批以上样品的测定结果,选择特征峰或数个色谱峰组成的具有特征性的色谱峰组合作为特征图谱。它并不要求共有的色谱峰越多越好,而是在色谱图中选定一个参照峰(一般是峰面积较大,分离度较好的主峰),计算特征峰的相对保留时间及其RSD,2010年版《中国药典》规定相对保留时间在±5%之内,对相对峰面积未做具体要求;不需要计算相似度,策略学考察也要将相对峰面积及相对保留时间考察在内,所以中药特征图谱是一种定性的中药质量制约策略。2010年版《中国药典》首次建立了HPLC色谱“指纹/特征图谱”策略,来制约部分中药品种的质量,以保证同一产品不同批次之间的质量均一性,减少不同厂家产品之间的差异。2010年版《中国药典》收载高效液相色谱指纹图谱共13项,如丹参酮提取物、三七总皂苷、莪术油、复方丹参滴丸等,其中相似度最小不得低于0.85;特征图谱共7项,包括人参茎叶总皂苷、人参总皂苷、山楂叶提取物等。指纹图谱技术的运用,可以有效的制约中药的质量,对于提高中药质量,推动中药现代化具有重要作用。但由于同种药材的产地、采收期不尽相同,加之不同制药企业对同种药材加工工艺各异,如果同一种中药确定同一个“指纹图谱”来制约,有相当的难度。因此,采取“特征图谱”的策略来制约中药质量,只对主要共有特征峰的相对保留时间作出规定,忽略相对峰面积及峰面积较小的峰,更符合中药的特点,也是中药质量制约未来发展的主要方向。
本实验采用高效液相色谱法,建立了荆芥防风药对的特征图谱,规定了荆芥防风药对有特征峰的相对保留时间,为该药对的质量制约提供了依据。可以看出11批供试品中有10批相似度均大于0.9,只有一批(130616-4)相似度较低为0.797;且不同供试品中化学成分含量相差较大,例如13号共有峰,相对峰面积RSD高达80%。因此,不同产地、不同采收时期对药材化学成分的种类及含量的影响至关重要。同时,如何统一药材原料质量,保证临床用药的稳定性、有效性及安全性,有待进一步深入探讨。
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[12] 荆芥防风药对的HPLC特征图谱论文资料由论文网www.7ctime.com提供,转载请保留地址.胥庆华,刘丽云,赵瑞华.中药药对大全[M]. 北京:中国中药出版社,1996:360.
HPLC specific chromatograms of drug pair of Schizonepetae
Herba and Saposhnikoviae Radix
YU Li-xia,SHAN Ming-qiu,DING An-wei*
(Jiangsu Key Laboratory for Traditional Chinese Medicine Formulae Research,Nanjing University of
Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)
[Abstract] In this experiment,the HPLC specific chromatogram was adopted,with Agilent Extend-C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) as the chromatographic column,and 0.5‰ trifluoroacetic acid and acetonitrile as the mobile phase for gradient elution,so as to establish specific chromatograms for drug pair of Schizonepetae Herba and Saposhnikoviae Radix from different producing area,identify 12 common characteristic peaks,and obtain the comparison specific chromatography of drug pair of Schizonepetae Herba and Saposhnikoviae Radix. The method is simple,accurate and highly reproducible,and thus can be used as the basis for the quality control of the drug pair.
[Key words] Schizonepeta Herba;Saposhnikovia Radix;drug pair;specific chromatogram
doi:10.4268/cjcmm20140425