浅析丹参素在局灶性脑缺血大鼠体内药动学—药效学相关性

论文导读：
[摘要]为探讨丹参素在脑缺血损伤模型大鼠体内的药动学过程及其与抗脑缺血作用的相关性，该文建立了局灶性脑缺血再灌注（MCAO）模型，静脉注射丹参素（40 mg·kg-1）后，采用HPLC-DAD测定不同时间丹参素血药浓度，绘制药-时曲线；同时测定各时间点血浆中超氧化物歧化酶（SOD），乳酸脱氢酶（LDH）活性，绘制时-效曲线；用DAS 3.2.6 软件处理数据，并进行相关性分析，比较相同剂量的丹参素给药后在模型及正常大鼠体内的药动学差异以及模型大鼠给药后的药效学指标变化，评价丹参素在治疗脑缺血疾病中的作用。结果，脑缺血再灌注及正常大鼠体内丹参素药动学过程均符合二室模型，主要药动学参数t1/2α分别为（0.267±0.026），（0.148±0.020） h，t1/2β分别为（1.226±0.032），（1.182±0.082） h，AUC0-∞分别为（42.168±4.007），（26.881±1.625） mg·L-1·h，缺血再灌注后大鼠血浆中SOD活性降低，LDH活性升高，丹参素在一定时间内能抑制SOD活性下降，LDH活性上升。表明丹参素在脑缺血再灌注大鼠在体内较正常大鼠体内滞留时间更长，消除减慢，反映了丹参素临床治疗脑缺血疾病的合理性；丹参素抗脑缺血损伤作用可能与其在体内水平有关，其血药浓度与血浆中SOD活性呈正相关，LDH活性呈负相关。
[关键词]丹参素；药动学；药效学；抗脑缺血损伤
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根茎，在临床上广泛用于心血管系统疾病的治疗，临床观察和动物实验都证明丹参具有广泛而复杂的药理活性[1]。丹参素是丹参的主要活性成分之一[2]，文献报道，丹参素对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[3]，有关其药动学研究已有不少[4-6]，但大多限于正常大鼠，关于其在脑缺血大鼠中的药动学研究以及药动学与药效学相关性研究尚未见文献报道。本实验采用HPLC-DAD检测丹参素血药浓度研究其药动学，测定相应时间点血浆中SOD，LDH活性指标研究丹参素抗氧化能力，同时评价丹参素在脑缺血大鼠中药动学及药效学过程的相关性，指导丹参素抗脑缺血疾病的临床合理用药。
1材料
1.1动物
清洁级SD大鼠，雄性，体重（280±20） g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2013-0016。
1.2试药
丹参素（HPLC检测纯度>98%）购自西安鸿生生物技术有限公司；丹参素钠对照品（质量分数>98%，上海源叶生物科技有限公司，批号20120911）；对羟基苯甲酸（内标，纯度≥99%，上海五连化工厂）；肝素钠（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号2B010350）；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（批号20130627）、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（批号20130813）均购自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈均为色谱纯（Tedia公司），其他试剂均为分析纯。
1.3仪器
Agilent 1200型高效液相色谱系统（包括G1311A四元梯度泵、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列检测器、G1315D DAD检测器、G1322A在线脱气机和化学工作站）。ND100-1氮气吹扫仪（杭州瑞诚仪器有限公司）；QL-861涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XS205DU梅特勒精密天平（METTLER TOLEDO公司）；SpectraMax Plus384酶标仪（美国MD公司）；CASCADA BIO MK2超纯水仪（美国PALL公司）；2-16PK离心机（德国Sigma公司）。
2策略

2.1脑缺血模型制作

SD大鼠按体重分为模型组和正常组。模型组大鼠用10%水合氯醛（350 mg·kg-1）腹腔麻醉后迅速按照Longa等[7]的策略进行大脑中动脉局灶性栓塞，缺血1 h后拔出鱼线进行再灌注，扎紧切口，缝合回笼。模型成功的标志是动物苏醒后，大鼠出现右眼Horner征；提尾时左前肢内收屈曲；爬行时向左侧转圈或倾倒。最后取脑，脑内有凝血块或蛛网膜下腔出血者舍弃。

2.2给药与采血

12只SD大鼠，实验前适应喂养5 d，给药前12 h禁食，自由饮水。正常组组及模型组大鼠术后1 h取空白血浆0.5 mL。模型组大鼠缺血1 h，再灌注同时给药。2组大鼠均尾静脉注射丹参素生理盐水溶液（40 mg·kg-1），分别于给药后0.083，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，12 h眼眶取血0.6 mL，经肝素钠抗凝，4 000 r·min-1离心10 min，分离血浆，-20 ℃冰箱冻存待分析。模型组血浆分装成2份，一部分用于药动学实验，另一部分用于药效学实验。

2.3药动学实验

2.3.1 色谱条件 Eclipse XDB-C1丹参素在局灶性脑缺血大鼠体内药动学—药效学相关性相关论文由www.7ctime.com收集,如需论文.8色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相采用二元体系，乙腈-0.3%磷酸（10∶90）。柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量10 μL，内标法峰面积定量。
2.3.2血浆样品的处理 精密量取0.2 mL血浆，加入10 μL内标溶液（20 mg·L-1），混匀，加入50 μL 20%冰醋酸，涡旋混匀，再加入0.6 mL甲醇，涡旋4 min后，12 000 r·min-1离心10 min，取780 μL上清液氮气吹干，100 μL流动相复溶，12 000 r·min-1离心10 min后，取上清待测。2.3.3对照品溶液的配制 精密称取丹参素钠对照品、对羟基苯甲酸适量，分别用1%冰醋酸配成质量浓度为1 g·L-1的储备液，于4 ℃保存。临用前，精密量取丹参素钠储备液适量，用大鼠空白血浆稀释成质量浓度为100，50，25，5，0.5，0.1 mg·L-1的系列标准溶液；精密量取对羟基苯甲酸储备液适量，用空白血浆稀释成质量浓度为20 m论文导读：
g·L-1的内标溶液。
2.3.4专属性考察 在选定的色谱条件下，得到HPLC图，见图1。丹参素与内标对羟基苯甲酸分离完全，峰形良好，保留时间分别为3.3，

7.3 min。血浆内源性物质不干扰丹参素与内标的测定，策略的专属性良好。

2.3.5线性关系考察 取丹参素钠系列标准工作液，按2.3.2项下策略处理，测定。以血浆中丹参素钠的质量浓度（mg·L-1）为横坐标，丹参素钠与内标的峰面积比值为纵坐标作图，用加权回归方程得丹参素钠标准曲线Y = 0.036 2X + 0.031 4，r=0.999 7，丹参素钠血浆中质量浓度在0.1～100 mg·L-1呈良好线性关系。按信噪比3∶1计，得丹参素的检测限为0.05 mg·L-1。
2.3.6精密度试验 取丹参素钠0.5，12.5，50 m丹参素在局灶性脑缺血大鼠体内药动学—药效学相关性由提供海量免费论文范文的www.7ctime.com,希望对您的论文写作有帮助.g·L-1 3个质量浓度的血浆标准液，按2.3.2项下策略处理，在相应色谱条件下进样。于1 d内测定5次计算日内精密度，1 周内测定5 d计算日间精密度。日内精密度分别为1.99%，2.36%，0.52%。日间精密度分别为4.23%，4.05%，1.47%。日内、日间RSD均<10%（N=5），所建立的检测方法精密度符合药动学分析要求。
2.3.7回收率试验 取空白血浆0.2 mL，加入不同质量浓度的丹参素钠标准溶液，制成高、中、低3种不同质量浓度的血浆样品，按与血浆样品相同的处理策略进行处理和测定。将丹参素钠峰面积与内标峰面积之比代入标准曲线方程计算丹参素钠质量浓度，以测得值与加入值之比计算回收率（N=5）。结果丹参素钠高、中、低质量浓度的回收率分别为（93.1±

1.56）%，（99.2±3.71）%，（105±

4.34）%。

2.4药效学试验 按试剂盒操作说明分别对同一血源不同时相SOD和LDH活性进行测定。

2.5统计学处理

丹参素血药浓度数据及药效学数据采用Microsoft Excel软件和药动学计算程序DAS

3.

2.6处理，组间比较采用t检验，数据以±s表示。

3结果

3.1药动学结果

脑缺血及正常大鼠iv给予丹参素（40 mg·kg-1）生理盐水后，丹参素血药浓度随时间呈动态变化，药时曲线均符合二房室开放模型。其血药浓度-时间曲线见图2，药动学参数见表1。药动学数据及分析提示丹参素在正常和病理状态下的药动学过程存在一定差异。与正常组相比，丹参素在脑缺血大鼠体内的清除率（CL）均明显降低（P<0.01），分布相生物半衰期（t1/2α）也显著延长（P<0.01），此外，丹参素给药后12 h在正常大鼠体内已检测不到含量，而模型大鼠体内该点的药物能被测到，暗示丹参素在脑缺血再灌注大鼠体内代谢速率明显慢于正常大鼠体内，推测其可能与脑缺血过程相关。而且，丹参素在脑缺血大鼠体内的AUC较正常大鼠有很大增加（P<0.05），说明丹参素在疾病大鼠体内的生物利用度大大增加，从而有利于发挥药效，这符合中医辨证论治基础的用药治疗原则。

3.2药效学结果

实验测得正常大鼠空白血浆中SOD活性为（281.35±13.61） U·mL-1，LDH活性为（2 449.75±376.11） U·L-1。与正常组相比，模型组大鼠缺血再灌注时血浆中SOD活性为（235.82±23.68） U·mL-1显著降低（P<0.01），LDH活性为（3 567.75±612.32） U·L-1明显升高（P<0.01），表明脑缺血损伤造成大鼠体内SOD水平下降，LDH水平升高，这与文献报道一致[8]。模型组大鼠给予丹参素后，其血浆中SOD水平有所回升，45 min后开始下降，而LDH水平30 min内保持在再灌注时LDH水平以下，表明丹参素对脑缺血损伤有一定的保护作用，其效应-时间曲线见图3。

3.3药动学与药效学相关性分析

采用DAS 3.2.6软件，对丹参素血药浓度（X）与脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中SOD，LDH水平（Y）进行量效关系分析。用散点相关法，X取对数进行作图，见图4。以Y=a + b×lnX 数学模型进行拟合，结果YSOD=193.48+13.602×lnX（r=0.904，P<0.01）；YLDH=4 127.035-193.454×lnX（r=0.933；P2.3时，SOD活性处于较高水平，略微下降，与丹参素血药浓度具有时间滞后性；LDH活性处于较低水平，且下降较快，这可能与丹参素在1 h内处于较高水平有关。lnXRSOD，提示丹参素对LDH的效应作用可能略高于SOD。该数学模型拟合优度良好，血浆中SOD，LDH水平与丹参素浓度在一定范围内相关性良好。
4讨论
中药复方成分的复杂性和药效作用的多样性决定了其药动学-药效学结合模型研究的复杂性。近年有关丹参素体内药动学的报道虽然较多，实验结果却不尽相同，缺乏丹参素药动学和药效学关系的研究。很多中药制剂如丹参注射液、丹红注射液等用于治疗缺血性心脑血管疾病[9-11]，丹参素是其有效成分之一。丹参素属酚酸类化合物，在高浓度醇性溶液中极不稳定，故在配制丹参素对照溶液时，先用1%冰醋酸溶解，并于4 ℃避光保存，且在样品预处理以及检测中都加入了一定比例的酸性介质。含量检测中以对羟基苯甲酸为内标，在选定色谱条件下，血浆中内源性物质不干扰丹参素及内标的测定，策略操作简便，精密度及重现性均符合要求。实验证实，丹参素在正常及脑缺血再灌注大鼠体内均呈二室模型，结果与王娟报道一致[12]，但与正常大鼠相比，丹参素在脑缺血再灌组大鼠体内驻留时间更长，消除较慢，说明脑缺血再灌注损伤可以转变丹参素的代谢过程。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，LDH是糖酵解过程中一种重要的酶，研究丹参素的抗缺氧能力与解释其抗脑缺血作用机制密切相关。脑缺血再灌注损伤发生时，高浓度自由基对SOD大量消耗，脑组织破坏致LDH释放入血，血浆中SOD活性在一段时间内会持续降低[13]，而LDH活性升高[14]，故动态检测SOD，LDH活性不失为一种策略简单、又可初步判断病情、脑梗死面积及预后的参考策略。本研究分别检测了丹参素给药后，大鼠脑缺血再灌注后不同时间血浆中SOD和LDH活性的变化。结果发现丹参素能抑制血浆中SOD活性降低，LDH活性升高，说明丹参素对脑缺血损伤有一定的治疗作用。由图4可知SOD活性在30 min内略微回升，提示靶部位药物浓度与血药浓度并不一致，效应与血药浓度存在滞后现象，丹参素由室分布至SOD效应室需要一定时间。
本实验对丹参素在不同时间的血药浓度与SOD，LDH活性进行量效相关性分析，相关系数分别为0.904，0.933，P均<0.01，较好的拟合了药动学和药效学的实验结果，揭示丹参素在MCAO大鼠体内的药动学变化与药效学变化具有良好的相关性。丹参素在较高浓度水平具有明显抗脑缺血损伤作用，且具有时间依赖性。由于中药药效是多种成分相互协同作用的结果，故以中药某一单体成分进行药动学和药效学研究，并不能完全反映中药复方的真实情况。后续实验中，应建立中药多成分、多靶点的药动学和药效学研究，并建立合适的数学模型，更好的为临床用药提供参考。
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345.
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Study on pharmacokinetics-pharmacodynamics correlation of Danshensu in
rats with focal cerebral ischemia
AI Jin-chao1， ZHOU Hui-fen1， SHU Ming-chun1， DAI Liu-ling1， ZHENG Lu1， ZHANG Yu-yan1，YANG Jie-hong1， WU Xian-bin2， WAN Hai-tong1*
（1.Cerebrovascular Disease Research Institute， Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310053， China；
2.Zhejiang Wanli University， Hangzhou 315100， China）
[Abstract] To study the pharmacokinetic process of Danshensu in cerebal ischemia injury model rats and the correlation with its anti-cerebral ischemia effect. In this study， the middle cerebral artery occlusion （MCAO） model was established， in which all of the rats were intrenously injected of Danshensu at a single dose of 40 mg·kg-1. The HPLC-DAD method was applied to determine the plaa concentration of Danshensu at different time points and draw the drug-time curve. Meanwhile， the superoxide diutase （SOD） and the lactate dehydrogenase （LDH） activity were determined to draw the time-effect curve. The DAS 3.2.6 software was used to process the data， analyze t论文导读：ttothetwo-compartmentmodel.Themainpharmacokineticparameterswere：t1/2αwere（0.267±0.026），（0.148±0.020）h；t1/2βwere（1.226±0.032），（1.182±0.082）h；AUC0-∞were（42.168±4.007），（26.881±1.625）mg·L-1·h.Afterthecerebralischemia-reperfusion，theactivityofSODdecreasedandtheactivit
heir correlation， compare the pharmacokinetic difference between model and normal rats after the administration of the same doses of Danshensu and the changes in pharmacodynamic indicators of model rats after the administration， and evaluate the effect of Danshensu in treating the cerebral ischemia disease. According to the results， the pharmacokinetic processes of Danshensu in the cerebral ischemia-reperfusion and normal rats were consistent to the two-compartment model. The main pharmacokinetic parameters were： t1/2α were （0.267±0.026）， （0.148±0.020） h；t1/2β were （1.226±0.032）， （1.182±0.082） h；AUC0-∞ were （42.168±4.007）， （26.881±1.625） mg·L-1·h. After the cerebral ischemia-reperfusion， the activity of SOD decreased and the activity of LDH increased. Danshensu could inhibit the decrease in the SOD activity and the increase in the LDH activity within a certain period of time. This indicated that Danshensu could stay longer in cerebral ischemia-reperfusion rats than in normal rats and eliminated more slowly， which reflected the rationality of Danshensu in the clinical treatmen丹参素在局灶性脑缺血大鼠体内药动学—药效学相关性相关论文由www.7ctime.com收集,如需论文.t of cerebral ischemia diseases. Danshensu′s effect against the cerebral ischemic injury may be related with its level in vivo. Its plaa concentration is positively related to the SOD activity and negatively related to the LDH activity.
[Key words] Danshensu； pharmacokinetics； pharmacodynamics； anti-cerebral ischemia injury
doi：10.4268/cjcmm20141430
[责任编辑 陈玲]