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研讨芩百清肺浓缩丸药物配伍对黄芩苷吸收药动学比较

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论文导读:涡旋混合1min,12000r·min-1离心10min。按2.1项下色谱条件进行测定、分析。2.5策略学考察2.5.1策略专属性试验取空白血浆分别为空白血浆、加入50μL的芦丁储备液的空白血浆、加入50μL的芦丁储备液及30μL黄芩苷储备液的空白血浆;取大鼠灌胃黄芩苷单体后8h血浆样品加入30μL的芦丁储备液;按2.4项下样品处理策
[收稿日期] 2013-12-19
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项(2010ZX09101-104); 黑龙江省中医药科研项目(ZHY12-Z128); 黑龙江省杰出青年基金项目(JC200813)
[通信作者] *王伟明,博士后,研究员,硕士生导师,Tel:13904611646,E-mail:672566098
[作者简介] 李海龙,硕士研究生, Tel:15145154922, E-mail:799950751
[摘要] 将芩百清肺浓缩丸按中药方剂理论拆方并分组,通过给大鼠灌胃各受试药物组,比较各组黄芩苷药动学参数的变化,阐明芩百组方的合理性及臣药在组方中的重要作用。对大鼠进行分组,分别灌胃君药组(黄芩粗提物,主要为黄芩苷)、与君药组黄芩苷含量相等的臣药组及芩百组(全方组),在28 h内于不同时间点采集大鼠血浆,应用HPLC测定大鼠血浆中的黄芩苷的药时曲线,用97实用药动学计算程序对所得数据进行处理。通过对数据分析得出,芩百全方组大鼠血浆中黄芩苷的Cmax是君药组的4倍,AUC是君药组的6倍;芩百全方组大鼠血浆中黄芩苷含量最高,臣药组大鼠血浆中黄芩苷含量不及全方组,但明显高于君药组。通过以上药动学结果得知,芩百能明显增加黄芩苷的Cmax和AUC,芩百中的其他中药成分推动了黄芩苷在体内的吸收,表明芩百复方配伍的合理;臣药对黄芩苷的体内吸收有推动作用。
[关键词] 黄芩苷;配伍;药代动力学;芩百清肺浓缩丸
芩百清肺浓缩丸(简称“芩百”)是由黑龙江省中医药科学院依据经典古方历时20余年开发而成的中药院内制剂,是第一个用于临床试验的明确治疗支原体肺炎的中药制剂,具有清热解毒,润肺止咳之功效[1]。芩百组方以黄芩为君药,黄芩苷是黄芩的活性成分之一,但其体内吸收率比较低,生物利用度差,因此黄芩苷体内吸收的药动学研究一直是受到关注较多的课题[2]。本实验以黄芩苷在大鼠血浆中的不同时间点的浓度为指标,对芩百按中药方剂组方原理拆方,并通过药动学研究比较配伍后方中其他成分对黄芩苷的体内药动学的影响,证明该复方配伍的合理性。
1 材料

1.1 试药与试剂

黄芩苷(baicalin)对照品(批号110715-201016,中国食品药品检定研究院);芦丁(rutin)对照品(批号100080-200306,中国食品药品检定研究院);黄芩、百部、地龙等药材均购于北京同仁堂,经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定均符合药典规定[3];芩百及各受试组药物均为自制,采用HPLC测定芩百中含黄芩苷为35 mg·g-1;甲醇,HPLC色谱级,美国迪马(DIKMA)试剂公司;其余试剂为分析纯;水为超纯水。

1.2 动物

Wistar大鼠体重为(300±50) g,8周龄,吉林大学基础医学院动物实验中心提供,动物合格证号SCXK(吉)2011-0004, 动物饲养1周,给药前禁食16 h,自由饮水。

1.3 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪,2489紫外检测器(美国waters公司);SK250H型超声仪(上海科导超声仪器有限公司);BSA224S-CW型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];LG16-W型高速台式离心机(北京京立离心机有限公司);WH-3微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器有限公司);MTW-2800W型氮气浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);Milli-Q Reference System超纯水器(Millipore Inc.美国)。
2 策略与结果

2.1 色谱条件[4]

Waters C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相甲醇-0.4%磷酸溶液38∶62;检测波长280 nm;流速1.0 mL·min-1;柱温30 ℃;进样100 μL。理论塔板数按黄芩苷算不少于3 000,黄芩苷与内标及其他杂质峰分离良好。

2.2 受试药物分组

根据芩百方解,将组方中药物按中药君臣佐使组方理论拆方分组,君药组为黄芩(主要成分为黄芩苷),臣药组为黄芩、百部、地龙,芩百全方组,以上分组按处方工艺提取制备。

2.3 对照品溶液的配置

黄芩苷对照液:精密称取黄芩苷对照品1.6 mg于置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,得质量浓度为32 mg·L-1的黄芩苷储备液,冰箱4 ℃保存。
芦丁对照液(内标液):精密称取芦丁对照品8.1 mg于置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,得质量浓度为162 mg·L-1的芦丁储备液,冰箱4 ℃保存。

2.4 血浆样品的采集及处理

分别于给药前和给药后的0.167,1,3,6,8,10,12,14,16,28 h在大鼠眼底静脉丛取血0.5 mL,置于肝素钠处理过的离心管中,4 000 r·min-1离心15 min,分离血浆,置-20 ℃冰箱保存。取离心管,加入一定量的内标液,氮气气流下吹干,精密吸取血浆样品200 μL,加入甲醇2 mL,涡旋混合2 min,超声萃取10 min,6 000 r·min-1离心10 min,取上清液氮气气流下吹干,取200 μL流动相复溶,涡旋混合1 min,12 000 r·min-1离心10 min。按

2.1项下色谱条件进行测定、分析。

2.5 策略学考察2.5.1 策略专属性试验 取空白血浆分别为空白血浆、加入50 μL的芦丁储备液的空白血浆、加入50 μL的芦丁储备液及30 μL黄芩苷储备液的空白血浆;取大鼠灌胃黄芩苷单体后8 h血浆样品加入30 μL的芦丁储备液;按2.4项下样品处理策略操作,按2.1项下色谱条件测定,考察血浆中其他成分及内标对黄芩苷的干扰,见图1,可知血浆样品中黄芩苷与空白血浆中加入的黄芩苷保留时间一致,空白血浆及样品血浆中杂峰对黄芩苷无干扰,黄芩苷与内标芦丁分离良好。
2.5.2 黄芩苷标准曲线 精密取黄芩苷储备液1,5,10,20,30,50,80 mL于100 mL量瓶中,用甲醇定容。论文导读:
精密吸取空白血浆200 μL于离心管中,平行吸
A.空白血浆;B.空白血浆加内标;C.空白血浆加内标及黄芩苷;D.血浆样品加内标。
图1 大鼠血浆中的黄芩苷HPLC图
Fig.1 HPLC Chromatograms of baicalin in rat plaa
取6份,分别加入不同浓度的黄芩苷储备液0.2 mL,按2.4项下样品处理策略操作,按2.1项下色谱条件测定。每一浓度做5份平行样品。以黄芩苷峰面积与内标峰面积比的平均值(Y)为纵坐标,黄芩苷浓度(X,mg·L-1)为横坐标进行线性回归,得标准曲线方程。结果表明血浆中药物质量浓度在0.32~25.6 mg·L-1,黄芩苷峰面积与内标峰面积之间均呈良好的线性关系,标准曲线方程为Y=0.131X+0.031 6(r=0.999 8);RSD<10%,最低检出浓度为0.07 mg·L-1 。
2.5.3 精密度试验 分别于空白血浆中加入黄芩苷标准应用液,得质量浓度为0.6,3.6,21.6 mg·L-1的低、中、高3种浓度的血浆样品,每一浓度做5份平行样品,于1 d内测定,同一浓度每隔2 h测1次,计算日内精密度,分别为(0.089±0.003),(0.513±0.012),(2.78±0.160)。同上操作,于5 d内测定,同一浓度每隔1 d测1次,计算日间精密度,分别为(0.090 1±0.003 9),(0.522±0.018 3),(2.868±0.169 8)。
2.5.4 稳定性试验 分别于空白血浆中加入黄芩苷标准液,制备成质量浓度为16 mg·L-1的血浆样品6份平行样,按2.4项下样品处理策略操作,按2.1项下色谱条件测定3份,余下3份于-20 ℃冻存22 h,室温20 ℃溶解2 h,反复冻融3次后按2.4项下样品处理策略操作,按2.1项下色谱条件测定。记录峰面积,RSD为5.8%。
2.5.5 回收率试验 分别于空白血浆中加入黄芩苷标准应用液,得质量浓度为0.6,3.6,21.6 mg·L-1的低、中、高3种浓度的血浆样品,每一浓度做5份平行样品,按血浆样品策略处理下策略操作,记录黄芩苷及芦丁峰面积,以测定量与加入量之比计算策略的回收率,分别为(89.9±5.525)%,(95.68±5.116)%,(9

6.48±2.378)%。

2.6 受试药物组的药动学研究

取Wistar雄性大鼠18只,实验前禁食16 h,随机分成3组,分别灌胃给予君药组、臣药组芩百全方组,以上分组折算后黄芩苷的灌胃量均为237.6 mg·kg-1,按血浆样品的采集及处理策略操作,测定血药浓度。绘制各药物组给药后大鼠血浆中黄芩苷的药物浓度-时间曲线,见图2。可见配伍后的黄芩苷与君药中黄芩苷比较,都存在着,复方中黄芩苷的达峰浓度明显增加,血药浓度维持时间明显延长,且复方中黄芩苷的AUC显著的增加,说明复方的配伍明显影响了黄芩苷在体内的吸收,其结果是推动了黄芩苷的吸收。
图2 大鼠灌胃各药物组后黄芩苷平均血药浓度-时间曲线(±s,n=6)
Fig.2 The rats in all the treatment groups of baicalin mean plaa concentration-time curve(±s,n=6)
应用87/97实用药动学计算程序(中国药理学会数学药理专业委员会)对所得数据进行处理,根据药物动力学房室模型判断策略,按AIC最小原则确定房室模型,拟合血浆中药物浓度-时间数据模型,结果显示3组药物在大鼠体内的药代动力学均符合一室模型,所得的药代动力学参数见表1。
3 讨论
通过观察灌胃各组药物后所测得大鼠血药浓度的药动学参数发现,各组之间黄芩苷的药动学有着明显的差异,芩百全方Cmax能达到君药组的4倍,AUC能达到君药组的6倍, t1/2Ke也明显延长,表明芩百方中的其他组分推动了黄芩苷在体内的吸收,延长在体内的时间,说明了该方配伍的合理性[5]。实验结果表明,臣组大鼠血浆中的黄芩苷含量虽不及芩百全方,但明显高于君药组,其中百部与黄芩为临床常用药对[6],表明臣药对君药的的吸收有重要的推动作用,符合臣药在组方中的重要地位。
为了准确测定血浆中黄芩苷含量,在样品处理时,采用内标法,以芦丁为内标物;为了使血浆样品中内标物芦丁的峰和黄芩苷峰达到了良好的分离效果,参考文献并对色谱条件进行适当修改,转变了磷酸水相的浓度及流动相的比例。通过参考文献,在血浆样品的处理时,分别采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂对血浆蛋白沉淀处理,试验后发现采用甲醇对样品中芦丁和黄芩苷萃取效果优于其他溶剂且沉淀效果较好,经样品处理策略操作对样品中黄芩苷和芦丁的提取回收率能达到80%以上,符合要求[7]。
黄芩苷在大鼠体内的药动学属于一房室模型,君药组及复方在大鼠体内呈现典型的现象,在给药后的10 min内达到第一个峰,与文献报道相符[8]。黄芩苷的吸收过程主要是黄芩苷在β-葡萄糖醛酸苷酶的作用下转化成黄芩素,进入血液后在UDPG一葡萄糖醛酸转移酶的作用下,变成黄芩苷。前3 h内吸收差异较小,可能受吸收部位或吸收过程所需酶的限制[9]。
6 h后各实验组血浆中黄芩苷存在明显差异,首先臣药组及芩百组中黄芩苷各时间点的血药浓度与君药组比较均有明显增加,说明臣药及芩百全方能增加黄芩苷在体内时间及药物的吸收,可能为方中其他药物成分推动体内产生黄芩苷转化过程所需的酶或使酶活性增加,使黄芩苷转化量增加,进而吸收入血量增加;其次臣药组中黄芩苷虽不及全方,但明显高于君药组,符合臣药在中药方剂理论中辅助君药的作用[10],百部、地龙对黄芩苷入血吸收过程中所需的酶可能有推动作用,导致黄芩苷入血量增加;最后,通过黄芩苷药-时曲线得知,芩百全方对黄芩苷的吸收远大于君药组,说明了复方配伍和给药方式的合理性。
[参考文献]
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