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谈本科生教学中“非灌流法分离大鼠肝脏星形细胞”实验方法的改善

论文导读:

本科生教学中“非灌流法分离大鼠肝脏星形细胞”实验方法的改进目前,国内外主要采用肝门静脉灌流的方式分离肝星形细胞,此策略操作复杂,时程长,污染风险大,对于本科生实验教学学时有限制。本实验通过非灌流法分离大鼠肝星形细胞,与传统的灌流法相比,不需要一系列灌流设备,而且避开了肝门静脉插管等繁琐的操作,降低了污染的风险,在一定程度上减少了肝星形细胞的体外分离操作时间,从而进一步提高了细胞活性,为本科生实验教学实验策略进行了改善。此策略不论对于科学研究还是基础教学,均具有着重要的指导作用。
  一、该实验策略改善主要有三大特点
  (1)综合性:将细胞工程、组织工程等专业课程的基础实验内容融合于综合实验设计中, 将生物工程的多种技术有机结合在一起,既减少实验重复内容, 给予学生全局的观念,又有利于学生开阔视野,培养学生综合运用生物工程技能分析理由和解决理由的能力。
  (2)多样性:实验材料包括动物组织、实验细胞等。根据指导教师的专业背景和科研方向,开出次实验项目,让学生根据兴趣选择,具有较强的灵活性。
  (3)创新性:课程安排了由浅入深的不同层次的实验环节,首先进行实验技能的基本训练,在此基础上安排实验策略的改善,增加了设计性实验内容 。
  二、该实验策略改善创新点
  本实验采用更简洁、可行性更强,耗材更少的策略来提取肝脏星形细胞,与以往的灌流法相比在步骤、策略及提取纯度上均体现明显优势,力求在有效简化复杂提取工作的同时,获得纯度更好,状态更好的肝脏星形细胞,简化了实验策略、减少实验步骤、节省了实验时间。此策略的改善为本科生实验教学改革提供了简捷可靠的实验基础。
  【吉林大学 2013 年实验技术研究立项项目】项目负责人:石毅,“非灌流法分离大鼠肝脏星形细胞及其鉴定”( 20131104)
  三、实验策略
  (一)大鼠肝星状细胞的分离培养和鉴定
  1.大鼠肝星形细胞的分离
  断颈处死Wistar大鼠,用75%酒精浸泡大鼠进行全身消毒,打开腹腔取出肝脏,迅速放入离心管内,并用剪刀将肝脏尽量剪碎,加入PBS缓冲液,混合均匀,200g离心30s,沉淀组织块,如此反复洗涤3次以洗净肝脏组织中的血液成分。加入混合酶液(胶原酶IV溶液和链霉蛋白酶溶液1:1),37℃消化20min,收集消化液,并用适量PBS溶液洗涤组织块2次,收集清洗液,消化液和清洗液经400目尼龙膜过滤后,200g离心5min收集细胞。用PBS清洗2-3次后,细胞用高糖DMEM培养基悬起,在离心管中加入40% Percoll分离液,加上述细胞悬液,1200g离心20min,在培养基与分离液交界处的悬浮细胞即为肝星形细胞。将细胞接种在培养皿内,记为P1代细胞,细胞于37℃、5%CO2条件下,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行常规培养,隔日半量换液,并在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。
  2.肝星状细胞的体外分离培养
  当原代细胞长至80%左右时,对细胞进行传代。弃掉培养皿中培养基,加入PBS清洗2-3次后,加入含有EDTA的胰酶37℃消化,待细胞大部分脱落时,加入含有血清的培养基终止消化,轻轻吹打培养皿,待细胞充分脱落后,200g离心5min收集细胞。加入培养基重悬之后,均匀分配到培养皿中,37℃、5% CO2条件下继续培养。
  3.大鼠肝星形细胞的鉴定
  大鼠肝星形细胞的脂质油红O染色鉴定按脂质油红O染色试剂盒操作说明进行。
  四、实验结果
  (一)大鼠肝星形细胞的形态观察
  P1代细胞培养一段时间后,可见大鼠肝星细胞贴壁生长,细胞形态呈梭形或星形,细胞生长状态良好,于首次接种后的10-14天可用0.25%的胰酶进行传代处理。
  (二)大鼠肝星形细胞的脂质油红O染色结果
  肝星形细胞的细胞核经苏木素复染后可变为蓝色,由脂质油红O染色结果可见:细胞的胞质中含有大量脂滴,分散在细胞核周围,脂滴可被染为红色。
  (三)大鼠肝星形细胞的特异蛋白免疫组化染色结果
  免疫组化染色结果可见:大鼠肝星形细胞在结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、GFAP表达方面均呈阳性;从低倍镜下可以观察到,细胞的着色率在90%以上,由此可对细胞纯度进行初步评估;本实验分别取P2代和P5代细胞进行GFAP染色,染色结果一致,细胞着色比率未出现明显转变,进一步证实本策略分离的肝星形细胞,随着细胞传代的进行,纯度基本不会发生明显变化。
  本实验成功建立了大鼠肝星形细胞的非灌流分离模式,且所获星形细胞纯度较高,该策略稳定简便,减少体外分离操作时间,进一步提高了细胞活性,免疫组化染色结果显示细胞纯度可达90%以上,所以,该策略在分离肝星形细胞方面可以有效的利用本科生实验教学中,使本科生从动物组织取材开始,到组织工程种子细胞的分离、提取、纯化及鉴定,在整个实验过程提高了学生实验的综合能力,创新能力和实验的多样性。力争在实验教学中取得较好的效果。 全文地址:http://www.7ctime.com/tyjxlw/lw42751.html
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