谈洋葱伯克霍尔德菌复合群分子分型和药敏比较
最后更新时间：2024-03-10
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论文导读：内外此种策略对洋葱伯克霍尔德菌复合群的研究还相对较少。本次试验收集107株洋葱伯克霍尔德菌复合群，采用MALDI-TOFMS和hisA基因测序进行分子分型并对不同基因型的药敏情况进行分析。1材料与策略1.1材料1.1.1菌株来源浙江大学医学院附属第二医院临床分离洋葱伯克霍尔德菌复合群73株，四川省人民医院分离菌株34株，均经
洋葱伯克霍尔德菌复合群广泛分布在自然界中，可通过污染水、消毒液及导管等导致多种医院感染[1]。近年来随着各种介入性操作及免疫功能低下患者的增加，洋葱伯克霍尔德菌复合群在肺囊性纤维化、慢性肉芽肿及非肺囊性纤维化患者中的分离日益增加，已逐渐成为医院内感染的主要病原菌之一[2-3]。对该菌的鉴定策略方面，传统的生化策略由于缺乏标准、检出率较低等缺陷而无法广泛应用临床[4]。全自动细菌鉴定和药敏系统如：VITEK、BD PHOENIXTM System等对洋葱伯克霍尔德复合群的鉴定存在一定的困难，甚至发生错误的鉴定[5-6]。同时由于洋葱伯克霍尔德菌复合群对多种抗生素（如氨基糖苷类、碳青酶烯类）天然耐药，因此寻找快速准确的鉴定策略至关重要。目前国内外研究多采用16S rRNA基因测序、hisA基因测序等分子学策略鉴定临床洋葱伯克霍尔德菌复合群[7-10]，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry， MALDI-TOF MS） 是近年发展起来用于微生物快速检测的一项技术，此种策略快速、稳定、重复性好，是一种全新的用于微生物鉴定和分型的生物质谱技术[7-8]；但是在国内外此种策略对洋葱伯克霍尔德菌复合群的研究还相对较少。本次试验收集107株洋葱伯克霍尔德菌复合群，采用MALDI-TOF MS和hisA基因测序进行分子分型并对不同基因型的药敏情况进行分析。1材料与策略
1.1材料
1.1.1菌株来源浙江大学医学院附属第二医院临床分离洋葱伯克霍尔德菌复合群73株，四川省人民医院分离菌株34株，均经VITEK全自动细菌鉴定仪确定为洋葱伯克霍尔德菌复合群。
1.1.2试剂和仪器基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱、96孔加样板、标准相对分子质量蛋白I及多肽 （德国Bruker Daltonics公司）； MALDI-TOF MS所用试剂如三氟乙酸（TFA）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）、色谱纯乙腈、甲酸、无水乙醇（美国Sigma公司）；基因组提取试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；PCR仪（德国Biometra公司）；Taq酶及PCR反应相关试剂（日本Takara公司）；DNAMAN 6.0（美国洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较论文资料由论文网www.7ctime.com提供,转载请保留地址.Lynnon Biosoft公司）； 紫外成像系统（德国Whatman Biometra公司）；VITEK2 AST-GN16药敏卡 （法国生物梅里埃公司）。
1.1.3引物hisA基因测序引物为：hisA-F：5’-AGGACCCGGCGGCGAT-3’，hisA-R：5’-TGCAGC
ATCCCGTCGCG-3’。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2策略
1.2.1细菌的复苏培养将临床收集的107株洋葱伯克霍尔德菌复合群接种于中国蓝和哥伦比亚血琼脂平板，37 ℃孵育，直至细菌在培养基上生长良好。
1.2.2MALDI-TOF MS样品制备（1）细菌灭活：挑取2～3个中等大小菌落于1.5 mL离心管中，加入300 μL蒸馏水混匀，然后加入900 μL无水乙醇充分混匀、12 000 g离心2 min；（2）提取蛋白：离心后完全去除上层乙醇，下层沉淀加入50 μL 70%甲酸混匀，然后加入50 μL乙腈混匀，12 000 g离心2 min；（3）加样：离心后取上清1 μL点样于96孔加样板，样品干透后加入1 μL基质HCCA覆盖加样的位置；（4）校准定标：每次实验前需对仪器进行校准定标，标准蛋白采用配制的混合蛋白CPS （按标准蛋白I与多肽比例为4∶1配制）；（5）质谱分析和鉴定比对：质谱仪使用线性正性模式。使用355 nm波长以最大频率（60 Hz）采集2000～20 000 u范围内的样品蛋白图谱，每个样品的激光轰击次数为100次；仪器具体参数设置如下：加速电压20 kV，提取电压18.6 kV，聚焦电压6.5 kV，延迟提取时间150 ns。样品的质量图谱图通过Bruker Biotyper
1.2.4测序比对hisA基因PCR扩增产物送至上海生工公司进行测序，测序结果与GenBank数据库进行比对，符合率98%以上确定为可信菌种。
1.2.5药敏试验药物敏感性实验采用VITEK2 GN-AST16药敏卡对菌株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration， MIC）进行测定。
2结果
，甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑的MIC50 ≤20 μg/mL。B.cenocepacia和B.cepacia对头孢曲松和头孢吡肟的MIC50要高于B.multivoran（表2）。不同医院洋葱伯克霍尔德菌群对替加环素的药敏情况见表3，浙江省分离菌株的替加环素敏感率低于四川省分离的菌株。3
讨论
随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德菌已不是单一的一株菌，而是由多个基因变种组成的一群细菌，称为洋葱伯克霍尔德菌复合群。2001年Vandamme等利用rRNA-DNA杂交全细胞电泳和细菌表型标志物等策略将洋葱伯克霍尔德菌复合群分为9种基因型[9洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较由提供海量免费论文范文的www.7ctime.com,希望对您的论文写作有帮助.]。9种基因型的洋葱伯克霍尔德菌复合群表型相似，传统的生化策略已无法区别。Vitek全自动微生物鉴定仪只能鉴定临床菌株至洋葱伯克霍尔德菌复合群，而不能进一步鉴定至各个基因型；而各个基因型的鉴别则需要采用分子生物学策略完成[9]。以16S rRNA基因为代表的分子生物学策略是目前细菌鉴定的“金标准”，当传统生化反应及自动化仪器不能有效鉴定时，16S rRNA测序往往是绝大多数实验室首选的分子学策略。recA基因也用于洋葱伯克霍尔德菌复合群的鉴定[5]。2009年Papaleo等发现在洋葱伯克霍尔德菌复合群中含有一段442 bp的特异性组氨酸序列hisA，此特异性序列不仅可以区分临床上常见的绝大多数洋葱伯克霍尔德菌复合群，还可以进一步将B.cenocepacia区分为四个亚型[10-11]。本次实验以hisA基因测序作为细菌鉴定的“金标准”。尽管hisA基因测序能区分绝大多数洋葱伯克霍尔德菌复合群，但其鉴定成本相对较高、测序时间较长，通常需要3～4 d时间才能鉴定结果。
MALDI-TOF MS是近几年发展起来的一种全新的用于微生物鉴定和分型的生物质谱技术，该策略具有快速、稳定、重复性好的特点，在国外各级实验室已广泛用于微生物的检测与鉴定[12-13]，而在国内应用甚少。Bruker Daltonics公司的微生物鉴定数据库包含迄今为止临床上发现的所有70种152株洋葱伯克霍尔德菌复合群临床菌株。2012年Lambiase等[14]用MALDI-TOF对洋葱伯克霍尔德菌复合群进行了鉴定。笔者对不同地区两家医院临床上用VITEK全自动细菌鉴定仪鉴定为洋葱伯克霍尔德复合群的107株菌株采用hisA基因测序和MALDI-TOF MS进行重新鉴定和分子分型，其中106株两策略鉴定结果完全吻合，符合率为99.1%，唯一一株B.pseudomallei也是因为在质谱菌株库中缺乏数据而误鉴定为蛋白质图谱非常接近的B.thailandensis，而该情况在国内外均有发现[6，15]。笔者对该株菌株的蛋白质指纹图谱在MALDI-TOF MS Biotyper软件数据库中进行了建库和数据库的扩充。为在今后的使用中作为参照，可提高将来该复合群鉴定的准确性和特异性。此外MALDI-TOF MS的鉴定时间比传统手工策略、生化分析策略和分子生物学策略都要短，通常1个标本只需要3～5 min即可完成鉴定，大批量标本能够采用自动化的高通量操作。
使用分子分型发现在临床上分离的洋葱伯克霍尔德菌复合群中以B.cenocepacia为主，占约75%；其次是B.multivorans，约为15%，第三为洋葱伯克霍尔德菌，约为7%，其余菌株零星出现，不同基因型的分布与国外报道的有一定的差异[16]。而不同的基因型对抗生素的耐药性也有一定的差异，体现在三代头孢菌素和替加环素上，浙江省内医院分离的菌株耐药率要高于四川省医院分离的菌株。
参考文献
[1]Traczewski MM，Brown SD. In vitro activity of doripenem against pseudomonas aeru ginosa and burkholderia cepacia isolates from both cystic brosis and noncystic fibrosis patients[J]. Antimicrob Agents chemother， 2006， 50 （2）： 819-821.
[2] Kaitwatcharachaic， Silpapojak lK， itsurong S， et al. An outbreak of burkhoderia cepacia bactercmia in hemodialysis patients：an epidemiologic and modular study[J]. Am J Kidney Dis， 2000， 36（1）： 199-204.
[3] 吕火祥， 沈蓓琼， 胡庆丰， 等. 洋葱伯克霍尔德菌临床分离与耐药性的7年监测[J]. 中华检验医学杂志， 2005， 28（3）： 27-30.
[4] 张军民， 罗艳萍， 赵丽萍， 等. 临床分离洋葱伯克霍尔德菌鉴定策略的探讨[J]. 中华检验医学杂志， 2002， 25（6）： 333-335.
[5] Oderiz S， Palau MJ， Del Palacio P， et al. Evaluation of commercial systems VITEK 2 and API 20NE for identification of burkholderia cepacia complex bacteria from clinical samples[J]. Rev Argent Microbiol， 2011， 43（3）： 168-175.洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较相关范文由写论文的好帮手{#GetFullDomain}提供,转载请保留.
洋葱伯克霍尔德菌复合群广泛分布在自然界中，可通过污染水、消毒液及导管等导致多种医院感染[1]。近年来随着各种介入性操作及免疫功能低下患者的增加，洋葱伯克霍尔德菌复合群在肺囊性纤维化、慢性肉芽肿及非肺囊性纤维化患者中的分离日益增加，已逐渐成为医院内感染的主要病原菌之一[2-3]。对该菌的鉴定策略方面，传统的生化策略由于缺乏标准、检出率较低等缺陷而无法广泛应用临床[4]。全自动细菌鉴定和药敏系统如：VITEK、BD PHOENIXTM System等对洋葱伯克霍尔德复合群的鉴定存在一定的困难，甚至发生错误的鉴定[5-6]。同时由于洋葱伯克霍尔德菌复合群对多种抗生素（如氨基糖苷类、碳青酶烯类）天然耐药，因此寻找快速准确的鉴定策略至关重要。目前国内外研究多采用16S rRNA基因测序、hisA基因测序等分子学策略鉴定临床洋葱伯克霍尔德菌复合群[7-10]，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry， MALDI-TOF MS） 是近年发展起来用于微生物快速检测的一项技术，此种策略快速、稳定、重复性好，是一种全新的用于微生物鉴定和分型的生物质谱技术[7-8]；但是在国内外此种策略对洋葱伯克霍尔德菌复合群的研究还相对较少。本次试验收集107株洋葱伯克霍尔德菌复合群，采用MALDI-TOF MS和hisA基因测序进行分子分型并对不同基因型的药敏情况进行分析。1材料与策略
1.1材料
1.1.1菌株来源浙江大学医学院附属第二医院临床分离洋葱伯克霍尔德菌复合群73株，四川省人民医院分离菌株34株，均经VITEK全自动细菌鉴定仪确定为洋葱伯克霍尔德菌复合群。
1.1.2试剂和仪器基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱、96孔加样板、标准相对分子质量蛋白I及多肽 （德国Bruker Daltonics公司）； MALDI-TOF MS所用试剂如三氟乙酸（TFA）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）、色谱纯乙腈、甲酸、无水乙醇（美国Sigma公司）；基因组提取试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；PCR仪（德国Biometra公司）；Taq酶及PCR反应相关试剂（日本Takara公司）；DNAMAN 6.0（美国洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较论文资料由论文网www.7ctime.com提供,转载请保留地址.Lynnon Biosoft公司）； 紫外成像系统（德国Whatman Biometra公司）；VITEK2 AST-GN16药敏卡 （法国生物梅里埃公司）。
1.1.3引物hisA基因测序引物为：hisA-F：5’-AGGACCCGGCGGCGAT-3’，hisA-R：5’-TGCAGC
ATCCCGTCGCG-3’。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2策略
1.2.1细菌的复苏培养将临床收集的107株洋葱伯克霍尔德菌复合群接种于中国蓝和哥伦比亚血琼脂平板，37 ℃孵育，直至细菌在培养基上生长良好。
1.2.2MALDI-TOF MS样品制备（1）细菌灭活：挑取2～3个中等大小菌落于1.5 mL离心管中，加入300 μL蒸馏水混匀，然后加入900 μL无水乙醇充分混匀、12 000 g离心2 min；（2）提取蛋白：离心后完全去除上层乙醇，下层沉淀加入50 μL 70%甲酸混匀，然后加入50 μL乙腈混匀，12 000 g离心2 min；（3）加样：离心后取上清1 μL点样于96孔加样板，样品干透后加入1 μL基质HCCA覆盖加样的位置；（4）校准定标：每次实验前需对仪器进行校准定标，标准蛋白采用配制的混合蛋白CPS （按标准蛋白I与多肽比例为4∶1配制）；（5）质谱分析和鉴定比对：质谱仪使用线性正性模式。使用355 nm波长以最大频率（60 Hz）采集2000～20 000 u范围内的样品蛋白图谱，每个样品的激光轰击次数为100次；仪器具体参数设置如下：加速电压20 kV，提取电压18.6 kV，聚焦电压6.5 kV，延迟提取时间150 ns。样品的质量图谱图通过Bruker Biotyper
3.0软件与数据库进行比较，并用匹配分值来量化结果，同时给出最终结果。
1.2.3hisA基因PCRhisA基因扩增参数：每个循环为94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s；共循环30次反应，最后72 ℃保温10 min。每次扩增均设阳性和阴性对照。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统观察结果，目标条带大小为442 bp。1.2.4测序比对hisA基因PCR扩增产物送至上海生工公司进行测序，测序结果与GenBank数据库进行比对，符合率98%以上确定为可信菌种。
1.2.5药敏试验药物敏感性实验采用VITEK2 GN-AST16药敏卡对菌株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration， MIC）进行测定。
2结果
2.1hisA基因测序和MALDI-TOF MS鉴定结果
107株洋葱伯克霍尔德菌复合群采用两种策略鉴定，其中106株结果完全一致，符合率为99.1%，不符合的1株采用MALDI-TOF MS鉴定结果为B.thailandensis，采用hisA基因测序结果为B.pseudomallei。在MALDI-TOF MS数据库中尚未涵盖B.pseudomallei，生化反应最终支持为B.pseudomallei。洋葱伯克霍尔德菌复合群不同基因型的分布见表1，不同基因型的质谱图见图1。图14种洋葱伯克霍尔德菌复合群MALDI-TOF MS峰值图2.2洋葱伯克霍尔德菌复合群不同基因型药敏情况洋葱伯克霍尔德菌复合群不同基因型对青霉素类、头孢一代、氨基糖苷类和亚胺培南的MIC50和MIC90值均较高，而喹诺酮类抗生素环丙沙星和左氧氟沙星MIC50均为1 μg/mL论文导读：commercialsystemsVITEK2andAPI20NEforidentificationofburkholderiacepaciacomplexbacteriafromclinicalsamples.RevArgentMicrobiol，2011，43（3）：168-175.洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较相关范文由写论文的好帮手www.7ctime.com提供,转载请保留.上一页12，甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑的MIC50 ≤20 μg/mL。B.cenocepacia和B.cepacia对头孢曲松和头孢吡肟的MIC50要高于B.multivoran（表2）。不同医院洋葱伯克霍尔德菌群对替加环素的药敏情况见表3，浙江省分离菌株的替加环素敏感率低于四川省分离的菌株。3
讨论
随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德菌已不是单一的一株菌，而是由多个基因变种组成的一群细菌，称为洋葱伯克霍尔德菌复合群。2001年Vandamme等利用rRNA-DNA杂交全细胞电泳和细菌表型标志物等策略将洋葱伯克霍尔德菌复合群分为9种基因型[9洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较由提供海量免费论文范文的www.7ctime.com,希望对您的论文写作有帮助.]。9种基因型的洋葱伯克霍尔德菌复合群表型相似，传统的生化策略已无法区别。Vitek全自动微生物鉴定仪只能鉴定临床菌株至洋葱伯克霍尔德菌复合群，而不能进一步鉴定至各个基因型；而各个基因型的鉴别则需要采用分子生物学策略完成[9]。以16S rRNA基因为代表的分子生物学策略是目前细菌鉴定的“金标准”，当传统生化反应及自动化仪器不能有效鉴定时，16S rRNA测序往往是绝大多数实验室首选的分子学策略。recA基因也用于洋葱伯克霍尔德菌复合群的鉴定[5]。2009年Papaleo等发现在洋葱伯克霍尔德菌复合群中含有一段442 bp的特异性组氨酸序列hisA，此特异性序列不仅可以区分临床上常见的绝大多数洋葱伯克霍尔德菌复合群，还可以进一步将B.cenocepacia区分为四个亚型[10-11]。本次实验以hisA基因测序作为细菌鉴定的“金标准”。尽管hisA基因测序能区分绝大多数洋葱伯克霍尔德菌复合群，但其鉴定成本相对较高、测序时间较长，通常需要3～4 d时间才能鉴定结果。
MALDI-TOF MS是近几年发展起来的一种全新的用于微生物鉴定和分型的生物质谱技术，该策略具有快速、稳定、重复性好的特点，在国外各级实验室已广泛用于微生物的检测与鉴定[12-13]，而在国内应用甚少。Bruker Daltonics公司的微生物鉴定数据库包含迄今为止临床上发现的所有70种152株洋葱伯克霍尔德菌复合群临床菌株。2012年Lambiase等[14]用MALDI-TOF对洋葱伯克霍尔德菌复合群进行了鉴定。笔者对不同地区两家医院临床上用VITEK全自动细菌鉴定仪鉴定为洋葱伯克霍尔德复合群的107株菌株采用hisA基因测序和MALDI-TOF MS进行重新鉴定和分子分型，其中106株两策略鉴定结果完全吻合，符合率为99.1%，唯一一株B.pseudomallei也是因为在质谱菌株库中缺乏数据而误鉴定为蛋白质图谱非常接近的B.thailandensis，而该情况在国内外均有发现[6，15]。笔者对该株菌株的蛋白质指纹图谱在MALDI-TOF MS Biotyper软件数据库中进行了建库和数据库的扩充。为在今后的使用中作为参照，可提高将来该复合群鉴定的准确性和特异性。此外MALDI-TOF MS的鉴定时间比传统手工策略、生化分析策略和分子生物学策略都要短，通常1个标本只需要3～5 min即可完成鉴定，大批量标本能够采用自动化的高通量操作。
使用分子分型发现在临床上分离的洋葱伯克霍尔德菌复合群中以B.cenocepacia为主，占约75%；其次是B.multivorans，约为15%，第三为洋葱伯克霍尔德菌，约为7%，其余菌株零星出现，不同基因型的分布与国外报道的有一定的差异[16]。而不同的基因型对抗生素的耐药性也有一定的差异，体现在三代头孢菌素和替加环素上，浙江省内医院分离的菌株耐药率要高于四川省医院分离的菌株。
参考文献
[1]Traczewski MM，Brown SD. In vitro activity of doripenem against pseudomonas aeru ginosa and burkholderia cepacia isolates from both cystic brosis and noncystic fibrosis patients[J]. Antimicrob Agents chemother， 2006， 50 （2）： 819-821.
[2] Kaitwatcharachaic， Silpapojak lK， itsurong S， et al. An outbreak of burkhoderia cepacia bactercmia in hemodialysis patients：an epidemiologic and modular study[J]. Am J Kidney Dis， 2000， 36（1）： 199-204.
[3] 吕火祥， 沈蓓琼， 胡庆丰， 等. 洋葱伯克霍尔德菌临床分离与耐药性的7年监测[J]. 中华检验医学杂志， 2005， 28（3）： 27-30.
[4] 张军民， 罗艳萍， 赵丽萍， 等. 临床分离洋葱伯克霍尔德菌鉴定策略的探讨[J]. 中华检验医学杂志， 2002， 25（6）： 333-335.
[5] Oderiz S， Palau MJ， Del Palacio P， et al. Evaluation of commercial systems VITEK 2 and API 20NE for identification of burkholderia cepacia complex bacteria from clinical samples[J]. Rev Argent Microbiol， 2011， 43（3）： 168-175.洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏比较相关范文由写论文的好帮手{#GetFullDomain}提供,转载请保留.