分析塞络通灌胃后人参皂苷在大鼠体内药代动力学及脑分布

论文导读：系统，美国AppliedBiosystem公司产品；高效液相系统为Agilent1200系统。配置包括G1322A脫气机，G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器G1316A柱温箱，G1330B进样盘温控器，G1314B检测器，美国Agilent公司产品。台式高速冷冻离心机（MIKRO22R），德国Hettich公司产品。氮吹仪（Model18780），美国PIERCE公司产品。

1.2药品与试剂

[摘要]塞络通（SLT）是由人参、银杏叶、西红花组方，主治血管性痴呆的现代复方中药。为探讨SLT药效物质基础，并为给药方案提供依据，该文对治疗剂量SLT给与大鼠后，人参皂苷成分的血药浓度、药代特征、以及脑分布进行了研究。实验建立了同时检测生物样品中7种人参皂苷的高灵敏度LC-MS/MS分析策略，经过对线性、专属性、回收率、准确度、精密度的考察，所建立的分析策略符合临床前药代动力学研究要求。灌胃SLT 60 mg·kg-1后，7种目标成分均在大鼠血浆中检出，其中二醇型皂苷比三醇型的皂苷有更高的血药浓度和更长的消除半衰期。血浆中人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rb2/b3，Rc，Rd的平均消除半衰期分别为15.26，2.46，18.41，27.70，21.86，61.58 h；平均峰浓度分别为7.15，2.83，55.32，30.22，21.42，8.81 μg·L-1。SLT给药后人参皂苷成分能够迅速进入脑组织，但是随时间下降很快。人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc脑组织中含量较高的成分。研究结果显示服用SLT后，人参皂苷成分能够快速吸收入血并进入脑组织。人参皂苷，尤其是Rg1，Re可通过快速进入脑组织直接作用于神经细胞发挥作用；以二醇型为主的人参皂苷在血浆中长时间滞留，连续给药方式时会累计达到较高稳态血药浓度，它们可能是通过对外周的药理作用保护脑组织的主要成分。
[关键词]塞络通；人参皂苷；LC-MS/MS；药代动力学；脑分布
[收稿日期]2013-08-26
[基金项目]国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09101214）；北京市科技计划项目（Z121102001112006）；国家自然科学基金项目（81072929）
[通信作者]*刘建勋，研究员，中药药理方向，Tel：（010）62874049， E-mail：jianxun_liu@163.com
[作者简介]张颖，副研究员，研究方向为药代动力学，Tel：（010）62835641， E-mail：zhyingde@sina.com塞络通（简称SLT）是根据临床治疗缺血性脑血管病常用药物人参、银杏叶、西红花的疗效及经验，结合现代药理学研究结果研制开发的新型现代中药产品。具有益气活血、化瘀通络、健脑益智的功效，主治血管性痴呆、缺血性中风恢复期等疾病。 药理研究表明该药可保护脑组织，抑制炎症反应，改善络脉瘀阻证候的相关性转变[1]，升高脑内与学习记忆相关神经递质水平[2]，延迟痴呆病程发展，对缺血性中风及其引起的血管性痴呆有预防和治疗作用。实验中发现该药在血管性痴呆动物模型上较对照药达纳康、哈伯因表现出更强的升高中枢相关神经递质含量、改善空间学习记忆、抗氧化等作用[3]。
人参是该复方中的君药，其主要成分为人参皂苷。近代药理研究表明人参皂苷成分具有多种脑保护作用。例如人参皂苷Rg1（G-Rg1）能够减轻老年痴呆模型大鼠的记忆损伤[4]；人身皂苷Rb1和Rd都具对脑缺血损伤的神经保护作[5-6]。为探讨SLT药效物质基础，并为给药方案提供依据，本实验对治疗剂量塞络通给予大鼠后人参皂苷成分在体内的血药浓度、药代特征、以及在脑组织分布进行了研究。
1材料

1.1实验仪器

液相质谱联用仪（API 4000QTRAP），配有Turbo VTM离子源仓，离子喷雾和大气压电离离子源，以及Analysis 1.4.2数据处理系统，美国Applied Biosystem公司产品；高效液相系统为Agilent 1200系统。配置包括G1322A 脫气机，G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器G1316A柱温箱，G1330B进样盘温控器，G1314B检测器，美国Agilent公司产品。台式高速冷冻离心机（ MIKRO 22R），德国Hettich公司产品。氮吹仪（Model 18780），美国PIERCE公司产品。

1.2药品与试剂

G-Re对照品（批号110754-200421），G-Rg1（批号110703-200424），G-Rb1（批号110704-200420），G-Rb3（批号111686-200501）均为供含量测定用对照品，购自中国食品药品检定研究院。G-Rb2，Rc，Rd，Rf对照品购自南京青泽医药公司，纯度大于98%。塞络通制剂由中国中医科学院西苑医院药学室提供，批号060925，其中含人参总皂苷提取物45.5%，G-Rg1，Re，Rb1，Rb2/b3，Rc，Rd，Rf在总皂苷提取物中的含量分别为13.8%，4.62%，11%，2.11%，6.37%，1.17%，3.4%。流动相用色乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国Fisher公司产品。流动相用甲酸为美国J.T.Baker公司色谱纯产品。
1.3动物
实验用大鼠为雄性Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所，合格证号SCXK（京） 2005-0013。
2策略与结果

2.1对照品溶液的配制

分别精密称量人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd对照品2.00 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，配制成质量浓度为200 mg·L-1的储备液；分别精密称量人参皂苷Rc，Rb2，Rb3对照品1.00 mg，以甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，配制成质量浓度为500 mg·L-1储备液塞络通灌胃后人参皂苷在大鼠体内的药代动力学及脑分布由优秀论文网站www.7ctime.com提供,助您写好论文.。以上储备液均放置于4 ℃冰箱储存待用。

2.2血浆样品前处理

37 ℃水浴解冻样品后，精密吸取血浆200 μL，加入200 μL醋酸缓冲液（0.2 mol·L-1 pH 4.6）和400 μL的丙酮，涡流混合1 min，避光静置10 min，离心（15 000 r·min-1）10 min，分离上清液800 μL于50 ℃氮气流下吹干，残留物用1 mL的混合萃取液（乙酸乙酯与正丁醇的1∶1混合液，用水饱和）溶解，涡流混合1 min，15 000 r·min-1离论文导读：
心10 min，取上清液800 μL于50 ℃氮气流下吹干，加入100 μL的50%的甲醇液复溶，再次涡流混合1 min，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行LC-MS/MS分析。

2.3脑组织样品前处理

按照本实验室已建立的文献中血浆处理策略[7]，37 ℃水浴解冻样品后，精密吸取脑组织匀浆100 μL，加入1 000 μL混合萃取剂（乙酸乙酯与正丁醇的1∶1混合液，用水饱和），涡流混合1 min，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液800 μL于50 ℃氮气流下吹干，加入100 μL的流动相复溶，取上清液进行LC-MS/MS分析。

2.4血浆样品中人参皂苷成分的分析

液相条件：Agilent ZORBAX SB-C18分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），美国Agilient公司产品； Zorbarx SB-C18保护柱 （4.6 mm×12.5 mm，5 μm），美国Agilient公司产品； 流动相，A相，水-甲醇 198∶2，含有1 mmol·L-1乙酸铵；B塞络通灌胃后人参皂苷在大鼠体内的药代动力学及脑分布相关论文由www.7ctime.com收集,如需论文.相，甲醇，含有1 mmol·L-1乙酸铵。按照以下梯度洗脱的流动相比例变化：0～7 min，67% B～98% B，流速600 μL·min-1；7～9.5 min，98% B，流速600 μL·min-1；9.51～15 min，67% B，流速700 μL·min-1。柱温保持在30 ℃。
质谱条件：离子源为ESI源。气帘气体为103.425 kPa。源内温度 600 ℃。源内气体GS1：413.7 kPa。源内气体GS2：60 413.7 kPa。离子喷射电压（IS）：5 000 V。碰撞气（CAD）： High。检测方式：正离子检测。扫描方式：多反应监测（MRM）方式，用于定量分析的离子及其质谱参数，见表1。
表1人参皂苷成分定量离子及质谱参数
Table 1Ion transitions and mass spectrum parameters for the quantitation of ginsenosides

2.5脑组织样品中人参皂苷成分的分析

按照文献中描述本实验室已建立生物样品分析策略检测的脑组织样品中的人参皂苷成分[7]。

2.6塞络通药代动力学试验样品采集

健康雄性Wistar大鼠6只，体重（220±20） g，实验前12 h禁食不禁水，实验期间自由饮水，实验2 h后进食。按60 mg·kg-1的剂量灌胃给药（给药体积为10 mL·kg-1），分别于给药后0.083，0.167，0.333，0.667，1，1.5，2，4，6，8，10，12，24，36，48，60，72 h经大鼠眼眶静脉丛采血约0.4 mL，置肝素化离心管中，离心，吸取上层血浆，-30 ℃保存待测。

2.7塞络通组织分布试验样品采集

健康雄性Wistar大鼠24只，体重（220.0±15.0） g。随机分成4个时间组，试验前禁食12 h，给药2 h后自由进食与饮水。以塞络通 60 mg·kg-1的剂量灌胃给药，4个时间组的受试大鼠分别在给药后0.25，2，7，24 h取血后处死，立即解剖采集脑组织。用生理盐水冲净脑组织上残留血液后，用滤纸吸干水分，称重后，以1∶3（g∶mL）体积加入生理盐水，冰浴下高速匀浆。样品于-30 ℃保存待测。

2.8血浆分析策略学的确证

2.8.1专属性取大鼠空白血浆，按“血浆样品前处理”项下策略操作，获得大鼠空白血浆样品的色谱图；将人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rb2/b3，Rc，Rd对照品系列溶液加入大鼠空白血浆中，依同法进行样品处理，获得相应的标准样品色谱图；大鼠灌胃塞络通后的血浆样品，依同法操作，获得实测样品色谱图。结果表明在该处理策略下大鼠血浆及脑组织中内源性物质均不干扰人参皂苷的测定，实测样本和标准样本色谱行为一致。待测物G-Rb1，Rb2/Rb3，Rc，Rd，Re，Rg1的保留时间分别为7.77，8.30，7.83，9.01，

3.68，91 min。

2.8.2标准曲线及线性范围制作标准曲线当天取对照品储备液用50%甲醇逐级稀释成系列标准溶液。取空白大鼠血浆900 μL，加人参皂苷类成分系列标准溶液100 μL，配制成相当于系列标准血浆样品，精密吸取200 μL按“样品处理”项下依法操作，进样20 μL，进行LC-MS/MS分析；以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。各成分在血浆中的典型标准曲线为：G-Rg1，y=1.32×104x+9.91×103，r=0.987，线性范围0.16～100 μg·L-1；G-Re，y=1.97×104x+3.41×103，r=0.990，线性范围0.16～20 μg·L-1；G-Rb1，y=1.06×103x+1.48×103，r=0.998，线性范围0.8～500 μg·L-1；G-Rd，y=2.05×103x+487，r=0.995，线性范围0.8～500 μg·L-1；G-Rb2，y=1.16×103x+497，r=0.995，线性范围0.8～500 μg·L-1；G-Rc，y=1.11×103x+319，r=0.995，线性范围0.8～500 μg·L-1。
2.8.3回收率在标准曲线范围内选择低、中和高3种浓度，以空白血浆配制各人参皂苷3个浓度的QC样品，每个浓度点5份样品，同时配制相同浓度以检测流动相为基质的标准溶液。将相同浓度的样品在同1 d按照样品处理策略与处理后分析，每份样品进样1次。同时将未经预处理的同浓度标准溶液以同样策略分析。以QC样品峰面积和标准溶液峰面积相比计算回收率，3种浓度下的大鼠血浆中各人参皂苷成分的回收率基本一致，平均值分别为62.9% （G-Rg1），58论文导读：论文资料由论文网www.7ctime.com提供,转载请保留地址.上一页123
.4%（G-Re），20.8% （G-Rb1），38.5% （G-Rb2），17.0%（G-Rc），30.4%（G-Rd）。塞络通灌胃后人参皂苷在大鼠体内的药代动力学及脑分布相关范文由写论文的好帮手www.7ctime.com提供,转载请保留.塞络通灌胃后人参皂苷在大鼠体内的药代动力学及脑分布论文资料由论文网www.7ctime.com提供,转载请保留地址.