DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变比较-

论文导读：
【摘要】目的基于多重PCR和反向线性杂交原理，建立HBV基因分型及耐药突变检测的新方法。方法对深圳地区的HBV进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。结果在45份标本中DNA序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 LAM相关突变24份（53.33%），与 ADV 相关突变3份（6.66%），与LdT相关突变1份（2.22%），与ETV相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。结论检测HBV不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究HBV的流行病学规律提供新的方法，为HBV感染的治疗提供用药指导，从而也为HBV的感染控制提供新的诊断工具。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；DNA测序；线性反向探针杂交法1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（HBV）携带者，每年约有80万人死于HBV慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。乙型肝炎病毒（HBV）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)等简便、副作用少、能迅速抑制HBV复制。但其耐药性问题也日益突出。本研究采用基于巢式 PCR 的 HBV P 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 HBV 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 HBV DNA 耐药突变位点进行分析。现将实验结果报告如下。
1病例资料
2008 年 10月 2009 年 10月本院门诊及住院的慢性乙型肝炎患者43例，其中男32例，女11例，年龄19—65岁，平均年龄36.5±9.4岁。诊断符合慢性乙型肝炎防治指南的标准［2］，并符合以下条件：HBsAg 阳性超过6个月；既往接受核苷/酸类药物治疗至少6个月；治疗期间血清 HBV DNA 低于检测最低浓度（1 103copies/mL）或较基线下降 2 log10 copies/mL后，出现病毒学反弹（HBV DNA1 103copies/mL，或 HBV DNA 自最低 值上升>1log10copies/mL），并伴有或无ALT升高。本次研究以征求患者同意。
2方法
2.1HBV 相关标志物和血生化检测：HBV 血清学标志物的检测采用ELISA试剂盒，常规检测血生化（包括肝功能）指标，血清HBV DNA检测采用荧光定量PCR技术和PE5700 型 DNA 扩增仪。最低检测值为 1×103copies/mL。

2.2HBV P 基因耐药突变检测

2.1标本提取

2.2取待测血清30μl，DNA提取液30μl制做备用。

2.2.3HBV DNA P 区逆转录酶片段扩增及序列测定GenBank 收录的HBV基因全序列，主要选取HBV adr 亚型 采用 Oligo

6.67 软件辅助分析，设计巢式引物。

3.1.3随机抽取上述患者中的20份血清标本，用线性反向探针杂交法（INNO-LiHBV DR v3，Innogenetics N.V，Belgium）检测已知的9个耐药位点，即 HBV DNA 聚合酶的第204、180、236、233、18

1、184、20

2、229和250位氨基酸。

2.3操作方法 2.3.1首先取10μl提取的HBV DNA 作为模板，加入高保真耐热DNA 聚合酶0.5μl；加5×缓冲液10μl和25mol/L的dNTP4μl，再加入生物素标记的引物；95℃预变性15min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s；50个循环；72℃延伸10min；扩增后的被生物素标记的DNA 产物与固定在尼龙膜检测条带上的特异性寡核苷酸探针进行杂交，未能杂交的DNA从条带上被洗脱。随后加入标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素，与杂交产物上标记的生物素结合。最后加入BCIP/NBT显色底物进行孵育，结果为紫/棕色沉淀物［3］。
2.3.2统计学处理 采用 SPSS11.0 软件进行 One-Way ANOVA 分析，组间比较应用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义.
3结果
3.1 主要血生化指标的变化:慢性乙型肝炎对不同核苷/酸类药物具有不同的敏感性，其在不同时间区域内，HBV DNA和ALT与治疗前相比均明显降低；LAM组和联合用药组的HBV DNA在治疗后的24个月比前6个月内升高。差异均具有统计学意义（P<0.05）。
3.2 HBV P 基因突变情况:20份血清样本经巢式 PCR 扩增后，成功18份（90.0%），其中血清HBV DNA<1×103copies/mL者3例，扩增1例，证明巢式PCR反应灵敏度较高；LAM、ADV、LdT和ETV耐药明确相关的9个位点的突变证明，在43份样本中，共检测到突变位点38个。与LAM相关的耐药23份（53.48%）。其中8份标本检出M204I突变，与LdT相关的耐药3份；对ETV的4份耐药见于多药耐药的患者，以T184位突变为主；对LdT产生交叉耐药3份；与ADV相关的耐药发生率为5份。
3.3基于反向线性杂交技术的INNO-LiPA的检测情况:在20份血清标本中检出以下突变形式：2例L180M+M204V；1例L180M；8例M204I+M204V；2例M204I；N236T、A181V、A181T、L80I、L80V各1例。
3.4两种方法检测比较:20份血清中，DNA序列测定法检出以下突变形式：M204I（5份），L180M+M204V（7份），L180M +M204I，L180V+V184I，L180M+M204V，L180I+N184T，A181T源于：7彩论文网高中英语论文www.7ctime.com
，N236T，L229W（各1份）。21份标本中两种方法检测结果一致的为18/21（8

5.71%），氨基酸位点一致的为225/231（9

7.40%）。结果不一致的3例。

4讨论 在慢性乙型肝炎治疗过程中密切监测耐药突变已成为抗HBV治疗顺利实施的重要措施。建立操作简便，快速、敏感、高通量。