探讨应激束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤内质网应激机制

论文导读：腺皮质轴的强烈兴奋，并伴有多种内分泌激素的转变。本室前期探讨证明，束缚应激可加重挤压伤大鼠肾脏损伤，表明应激在肾损伤发生中可能发挥重要意义，但机制尚不清楚。内质网是细胞内蛋白质折叠和成熟的场所。大量的探讨表明应激激素极为代谢性产物，细胞因子，氧自由基等均可干扰蛋白质加工运输，引发内质网应激(endoplamicretic
摘要：目的：临床资料和法医尸检报告证实，在交通事故、刑讯逼供、等事件中，非致命性机械性损伤后伤员经常发生肾损害、肾衰乃至死亡。由于机械性损伤本身问题从致人死亡，由此常常由于死亡理由不能确定而引起争议，导致案件久拖不决，给社会造成不良影响。此外，在临床实践中也经常发生受伤患者在治疗期间病情加重，致使医务人员难从应对，医患联系紧张。由此探讨此类损伤引发肾损伤的确切机制是法医病理学亟待解决的科学技术不足。损伤作为躯体应激原可引起机体应激反应；此外当事人在遭受损伤后往往会产生焦虑、紧张或抑郁等不良情绪，作为心理社会因素常引起机体超常应激反应，这种状况常被忽略。应激时，机体通过神经内分泌体系的协调意义对应激原作出整体反应，如蓝斑-交感-肾上腺髓质体系和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的强烈兴奋，并伴有多种内分泌激素的转变。本室前期探讨证明，束缚应激可加重挤压伤大鼠肾脏损伤，表明应激在肾损伤发生中可能发挥重要意义，但机制尚不清楚。内质网是细胞内蛋白质折叠和成熟的场所。大量的探讨表明应激激素极为代谢性产物，细胞因子，氧自由基等均可干扰蛋白质加工运输，引发内质网应激(endoplamic reticulum stress, ERS)。ERS是应激时重要的细胞反应之一，其本质上对于增强细胞对损伤的抵抗及适应能力具有重要作用，但过度强烈或持续时间过长的ERS可通过诱导凋亡和炎症反应造成组织、细胞损伤。大量探讨表明，ERS可能是多种肾损伤发生的重要因素之一，但非致命性机械性损伤导致肾损伤的机制是否与ERS有关尚不明确。挤压伤模型是公认的复制肢体软组织挫伤的动物模型，束缚应激模型是公认的复制心理社会应激的动物模型。由此，为模拟实际案情，明确应激性损伤机制，本实验将采取束缚应激加挤压伤的复合模型即应激性损伤模型，研究束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制是否与ERS有关，为揭示非致命性机械性损伤导致肾损伤的确切机制提供实验依据。此外，实际法医检案中，免疫组织化学(Immunohisto chemistry，IHC)染色技术的运用受到组织固定时间和死后变化等因素的影响。故本实验拟在明确ERS在应激性肾损伤中的意义机制后进一步研究死后组织固定时间和环境温度对内质网应激相关蛋白抗原稳定性的影响，从期为非致命性机械性损伤及应激参与的死亡案件的死因鉴定提供论述依据，为建立诊断应激性损伤的指标系统提供实验技术办法。第一部分大鼠应激性损伤模型的建立从及肾脏内质网应激的激活目的：建立应激性损伤模型，观察大鼠肾损伤的组织形态学变化和超微结构的变化，并以整体水平研究大鼠应激性肾损伤时，ERS是否参与束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的历程。办法：实验分为正常对照组，禁食水组，束缚应激组，挤压伤组，应激性损伤(即束缚应激+挤压伤复合模型)组，溶剂DMSO对照组，Salubrinal (ERS抑制剂)组，Salubrinal+应激性损伤组，每组5只大鼠。于造模成功后处死大鼠，取材。每天实验后分别称取正常组、禁食水组和束缚应激组大鼠体重，从评估是否建立束缚应激模型。采取高效液相色谱-电化学检测法(highperformance pquid chromatography coupled to electrochemical detection,HPLC-ECD)，检测血浆中NE、E的含量变化；运用Western blot办法检测应激性肾损伤时GRP78蛋白表达水平；采取透射电子显微镜(tranissionelectron microscope, TEM)技术观察大鼠肾脏的超微结构变化；采取苏木素-伊红(Hematoxypn and Eosin, HE)染色法观察大鼠后肢肌肉组织、肾脏损伤的形态学变化；采取苦味酸法检测血浆中肌酐(creatinine, Cre)的含量变化；采取二乙酰肟法检测血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)的含量变化。结果：1大鼠后肢肌肉组织病理学观察与正常对照组相比，挤压伤组和应激性损伤组大鼠后肢肌肉组织均可见横纹肌溶解，间质出血水肿伴炎细胞浸润，该结果提示大鼠有着软组织损伤，故本实验成功的建立了大鼠挤压伤模型。2大鼠体重的变化正常对照组大鼠体重逐渐增多。而与正常对照组和禁食水组相比，束缚应激大鼠体重增长显著减缓(p0.05)，该结果提示本实验成功的建论文导读：
立了束缚应激模型。3大鼠血浆中NE、E浓度变化与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠血浆中NE、E的浓度显著升高(p0.05)。该结果提示束缚应激和挤压伤均能引发应激反应。而与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠血浆中NE、E的浓度显著升高(p0.05)。与正常对照组相比，应激性损伤组大鼠血浆中NE、E的浓度分别增高了2.29倍和3.30倍。这一结果提示，运用束缚应激后挤压的模式成功建立了应激性损伤模型，双重应激原共同刺激引发了机体超常应激反应。4大鼠肾脏组织超微结构观察禁食水组大鼠肾小管细胞核周间隙增大，内质网高度扩张，线粒体嵴和膜融合。束缚应激组大鼠肾小管细胞核固缩，核周间隙增大，内质网扩张，线粒体嵴和膜融合，质膜内褶排列紊乱。挤压伤组大鼠肾小管扩张，线粒体嵴和膜模糊融合，粗面内质网空泡化，细胞核轻度固缩。与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏组织超微结构损伤最显著，肾小管细胞核周间隙增大，染色质轻度边移，核周细胞器减少，线粒体外膜基本消失，内质网扩张，质膜内褶排列紊乱，肾小管细胞膜破裂。该结果提示束缚应激加重挤压伤大鼠肾脏超微结构损伤。5Western blot检测GRP78蛋白的表达与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏GRP78的表达显著增高(p0.05)，而给予ERS抑制剂Sal可显著抑制应激性损伤诱导的GRP78表达升高(p0.05)。该结果提示Sal可显著抑制ERS的启动，故本实验进一步观察了运用Sal后应激性肾损伤的形态学变化。6大鼠肾脏组织病理学观察与正常对照组相比，挤压伤组大鼠可见肾小球肿胀充血，少量炎细胞浸润及间质充血，而束缚应激组大鼠除可见上面陈述的病理转变外，尚可见炎细胞浸润。与挤压伤组大鼠相比，应激性损伤组大鼠肾脏组织病理学变化最显著，可见肾小球肿胀淤血，肾小管上皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，间质淤血。该结果表明束缚应激可加重挤压伤大鼠肾损伤。而运用ERS抑制剂Sal可显著减轻应激性损伤组大鼠肾损伤程度。而DMSO组和Salubrinal组大鼠肾脏仅可见少量的炎细胞浸润。该结果提示ERS可能参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的历程。7大鼠血浆Cre和BUN含量的变化与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠血浆中Cre和BUN的浓度显著升高(p0.05)。该结果提示束缚应激和挤压伤均能引发肾损伤。而与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠血浆中Cre和BUN的浓度显著升高(p0.05)。该结果表明束缚应激可加重挤压伤大鼠肾损伤。而运用ERS抑制剂Sal可显著减轻应激性损伤组大鼠肾损伤程度。该结果提示ERS可能参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的历程。小结：本部分实验成功建立大鼠应激性损伤模型，ERS抑制剂可减轻应激性肾损伤，初步证实ERS可能参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的历程。第二部分ERS介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制探讨实验一、ERS介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的凋亡机制目的：建立应激性损伤模型，以整体水平探讨ERS诱导凋亡是否参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的历程。办法：分组同第一部分实验。运用Western blot办法检测应激性肾损伤时ERS诱导凋亡的特异性蛋白CHOP、caspase-12和凋亡终末执行分子caspase-3蛋白表达水平；采取原位末端标记技术(TdT-mediated dUTP nickend labepng, TUNEL)观察大鼠肾脏的细胞凋亡状况。结果：1Western blot检测CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白的表达与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠肾脏CHOP、caspase-12和caspase-3表达均显著增高(p0.05)。与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏CHOP、caspase-12和caspase-3的表达均更加明显增高(p0.05)。而运用ERS抑制剂Sal均可显著抑制上面陈述的蛋白的变化(p0.05)。该结果提示束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制与ERS诱导的细胞凋亡有关。2TUNEL法检测肾脏组织细胞凋亡状况与对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠肾脏组织阳性细胞数目均显著增加(p0.05)；与挤压组相比，应激性损伤组大鼠肾脏组织的凋亡细胞数更加显著增多(p0.05)，而运用Sal可使凋亡细胞数显著减少(p0.0论文导读：用。该结果表明应激性损伤后一段时间内运用IHC技术仍能检测到GRP78和CHOP的表达。实验二、固定时间对GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响目的：探讨固定时间对大鼠应激性损伤的肾组织中GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。办法：实验分为正常对照组和应激性损伤组。每组5只大鼠，于造模后3d处死大鼠，取肾脏分别甲醛固定1d、3d、5d及7d后
5)。该结果证实束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制确实与ERS诱导的细胞凋亡有关。实验二、ERS介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的炎症机制目的：建立应激性损伤模型，以整体水平探讨ERS诱导的炎症反应是否参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的历程。办法：分组同第一部分实验。运用Western blot办法检测应激性肾损伤时单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的蛋白表达水平；肾组织固定石蜡包埋后，连续切片，采取IHC法观察大鼠肾脏的GRP78和MCP-1的表达状况。结果：1Western blot检测大鼠肾脏MCP-1蛋白的表达与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠肾脏MCP-1表达均显著增高(p0.05)。与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏MCP-1的表达更加显著增高(p0.05)，同时，运用Sal可显著抑制MCP-1的表达(p0.05)。该结果提示束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制与ERS诱导的MCP-1相关的炎症反应有关。2IHC法检测大鼠肾脏GRP78和MCP-1的表达与正常对照组相比，连续切片染色可见应激性损伤组大鼠肾脏组织相同部位同时有着显著增高是GRP78和MCP-1的阳性表达。该结果为ERS诱导与MCP-1相关的炎症反应提供了形态学上的证据。小结：束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤与ERS有关，ERS一方面通过激活CHOP和caspase-12凋亡通路诱导肾脏细胞凋亡，另一方面通过推动MCP-1的表达加重肾脏炎症反应。第三部分固定时间和环境温度对ERS标志性蛋白GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响实验一、GRP78和CHOP在大鼠应激性肾损伤中的持续表达目的：由于当事人常经历非致死性创伤后一段时间内才发生死亡，故建立应激性损伤模型，以整体水平探讨应激性肾损伤后一段时间内GRP78和CHOP的表达水平变化。办法：实验分为正常对照组和应激性损伤后0h,1d,3d,5d及7d组，每组5只大鼠。分别于造模后相应时间点处死大鼠，取材。采取IHC法观察大鼠肾脏的GRP78和CHOP的表达状况。结果：IHC半定量分析GRP78和CHOP在大鼠应激性肾损伤的持续表达应激性损伤后0h-7d大鼠肾脏GRP78和CHOP的表达水平均随时间的延长逐渐升高，在第3天达峰值，之后有所下降，但与对照组相比，均有统计学作用。该结果表明应激性损伤后一段时间内运用IHC技术仍能检测到GRP78和CHOP的表达。实验二、固定时间对GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响目的：探讨固定时间对大鼠应激性损伤的肾组织中GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。办法：实验分为正常对照组和应激性损伤组。每组5只大鼠，于造模后3d处死大鼠，取肾脏分别甲醛固定1d、3d、5d及7d后脱水，石蜡包埋。运用HE染色法观察大鼠肾脏组织形态学的变化；采取IHC发观察固定时间对大鼠肾脏的GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。结果：1固定不同时间对肾脏HE染色结果的影响固定时间对两组肾脏组织的HE染色结果没有显著影响。与正常对照组相比，应激性损伤组大鼠肾损伤显著加重，均可见肾小球肿胀淤血，肾小囊闭塞，肾小管上皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，间质淤血。2固定时间对肾脏GRP78和CHOP抗原稳定性的影响固定不同时间(3~7d)对肾脏GRP78和CHOP的抗原稳定性未见显著影响。与正常对照组相比，应激性损伤组肾脏GRP78和CHOP表达均显著增高(p0.05)。实验三、环境温度对GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响目的：探讨环境温度对大鼠应激性损伤后离体肾组织中GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。办法：实验分为正常对照组和应激性损伤组。每组5只大鼠，于造模后3d处死大鼠，取肾脏：①在4℃下分别放置1d、3d、5d、7d、9d及11d；②在17℃及25℃下分别放置1d、3d、5d及7d后进行取材、固定、包埋。运用HE染色法观察不同环境温度下大鼠肾脏组织形态学的变化；采取IHC法观察环境稳定对大鼠肾脏GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。结果：1不同环境温度下放置不同时间对肾脏组织结构的影响不同环境温度下，随着放置时间的延长，肾脏组织自溶变化逐渐显著加重。4℃放置至第9d，17℃和25℃分别放置至第3d，均可见不同程度的肾论文导读：
细胞结构模糊，部分细胞核缺失，胞浆溶解，胞浆呈均质化伊红色。但正常对照组和应激组大鼠肾脏形态学变化已无法区分。24℃和17℃保存对GRP78和CHOP抗原稳定性的影响4℃放置1~9d，17℃放置1~3d，应激性损伤组肾脏的GRP78和CHOP的表达强度与范围均逐渐减弱，但与对照组相比，仍有一定差别(p0.05)。325℃保存对GRP78和CHOP抗原稳定性的影响放置1~3d，应激性损伤组肾脏GRP78的表达强度与范围均逐渐减弱，但与对照组相比仍显著增高(p0.05)。放置1d，与对照组相比，应激性损伤组肾脏CHOP的表达强度仍显著增强(p0.05)，但随放置时间延长，其肾脏CHOP的表达强度与范围均逐渐减弱，放置3d~7d与对照组相比无显著差别。小结：1GRP78和CHOP抗原稳定性较好，在大鼠应激性损伤后肾脏组织固定7d从内，均可检测到GRP78、CHOP的表达。2GRP78和CHOP抗原稳定性较好，大鼠应激性损伤后肾脏组织在4℃放置1-9d、17℃和25℃放置1-3d内均可检测到GRP78的表达。CHOP抗原稳定性稍弱于GRP78，大鼠应激性损伤后肾脏组织在4℃放置1-9d、17℃和25℃放置1d内仍能检测到CHOP的表达。综上，本实验成功建立了大鼠束缚应激和挤压伤复合模型即应激性损伤模型，观察了损伤后大鼠肾脏的病理学变化；检测了肾脏中内质网应激、细胞凋亡及炎症因子表达状况；从及组织固定时间和环境变化对肾脏中GRP78和CHOP抗原稳定的影响，成功地建立了诊断应激性肾损伤的指标系统：(1)明确的机械性损伤(交通伤、地震、矿难、刑讯逼供等)的体表征象。(2)肾脏的组织学变化为肾小球肿胀淤血，肾小管上皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，间质淤血。(3)通过TUNEL可证实肾脏有着细胞凋亡，电镜下也可见肾小管细胞核周间隙增大，染色质轻度边移等凋亡现象。(4)肾脏ERS特异性蛋白GRP78和CHOP的表达显著增高。但该指标系统尚有待于在实际检案中进行验证。关键词：应激论文挤压伤论文内质网应激论文GRP78论文CHOP论文
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ABSTRACT13-24
英文缩写24-26
引言26-29
第一部分 大鼠应激性损伤模型的建立从及肾脏内质网应激的激活29-60
前言29-30
材料与办法30-39
结果39-41
附图41-50
附表50-51
讨论51-54
小结54
参考文献54-60
第二部分 ERS 介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制探讨60-80
前言60
实验

一、ERS 介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的凋亡机制60-68

材料与办法60-64
结果64-65
附图65-68
实验

二、ERS 介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的炎症机制68-75

材料与办法68-72
结果72-73
附图73-75
讨论75-77
小结77
参考文献77-80
第三部分 固定时间和环境温度对 ERS 标志性蛋白 GRP78 和 CHOP蛋白抗原稳定性的影响80-107
前言80
实验

一、GRP78 和 CHOP 在大鼠应激性肾损伤中的持续表达80-86

材料与办法80-83
结果83-84
附图84-86
实验

二、固定时间对 GRP78 和 CHOP 蛋白抗原稳定性的影响86-91

材料与办法86-87
结果87-88
附图88-91
实验

三、环境温度对 GRP78 和 CHOP 蛋白抗原稳定性的影响91-103

材料与办法91-92
结果92-94
附图94-103
讨论103-105
小结105
参考文献105-107
结论107-108
综述 内质网应激的探讨发展108-127
参考文献120-127
致谢127-128
个人简历128-129