浅谈染色体X-连锁智力障碍致病基因CUL4B介导Jab1/CSN5泛素化降解及其分子机制初步
最后更新时间：2024-02-19
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论文导读：phogeneticprotein,BMP)信号通路的抑制性蛋白(InhibitorySmads,I-Smads),Smad7蛋白的降解加快会使BMP通路异常活化。1)在HEK293细胞系中,干扰CUL4B表达后12下一页
摘要：CUL4B基因是本探讨所于2007年采取定位候选克隆办法发现的一个X染色体连锁智力障碍(X-pnked intellectual disabipty, XLID)致病基因,随后本探讨所对该基因进行了一系列的分析与探讨。CUL4B基因属于Culpn基因家族,CUL4B C末端结合ROC1(RING-box protein1,ROC1);N末端结合DDB1(DNA damage binding1, DDB1),然后后共同组成Culpn-RING E3泛素连接酶复合体(Culpn-RING Ubiquitin Ligases, CRLs), CUL4B在这个复合体中起支架蛋白的意义。本实验室使用差别蛋白组学分析发现,当CUL4B蛋白表达水平变化后几点蛋白随之变化,例如：Peroxiredoxin Ⅲ (Prx Ⅲ)、Triosephosphate isomerase1、 Annexin A5、Jab1/CSN5(Jun activating binding protein, Jab1)等。Prx Ⅲ是CUL4B E3泛素连接酶的特异性底物蛋白,Prx Ⅲ可从清除细胞内的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)。CUL4B突变会抑制PrxⅢ降解,导致PrxⅢ累积,以而使细胞内ROS水平异常降低,最终导致神经干细胞分化异常。CUL4BE3泛素连接酶复合体选择性降解WDR5,以而影响神经元细胞的特殊基因转录活性,以而使神经体系正常的生理功能出现异常。CUL4B E3泛素连接酶复合体的特异性底物可能对高等动物的神经体系的正常发育有重要意义。因而探讨CUL4B E3泛素连接酶的特异性底物,不仅可从帮助我们更好地理解CUL4B基因的生物功能,更重要的是有助于揭示CUL4B突变导致XLID的致病机制。第一部分CUL4B E3泛素连接酶介导Jabl/CSN5的泛素化降解在哺乳动物体内,CUL4有CUL4B和CUL4A两个高度同源的蛋白,CUL4E3泛素连接酶复合体的构成形式是ROC1-CUL4-DDB1的复合体形式。CUL4B在N末端特有的149个氨基酸残基可能使其在底物选择方面与CUL4A有着差别。为了探讨CUL4B特异性底物从极为与CUL4B基因突变导致的XLID的联系,我们在HEK293(Human Embryonic Kidney293cells, HEK293)、HeLa从极为它细胞中使用RNAi干扰技术降低CUL4B蛋白表达水平,进而对其可能的底物进行了筛选,发现Jab1/CSN5蛋白是CUL4B E3泛素连接酶复合体的底物。1)在HEK293细胞中,干扰CUL4B的表达后,发现Jab1/CSN5的蛋白水平有一定程度的升高,同时我们检测到Jab1/CSN5蛋白半衰期异常延长,说明CUL4B可从调节Jabl/CSN5蛋白的稳定性。2)在HEK293细胞中,蛋白酶体抑制剂也会引起Jab1/CSN5蛋白水平的异常升高,说明Jab1/CSN5是经由26s蛋白酶体进行降解。31在HEK293细胞中,干扰ROC1或者DDB1的表达后,Jab1/CSN5蛋白水平有显著的升高且其半衰期显著延长；而当干扰CUL4A的表达后,并没有检测到Jabl/CSN5蛋白水平的升高从极为半衰期的变化。说明Jab1/CSN5的泛素化是由ROC1-CUL4B-DDB1复合体参与的。4)在HEK293细胞中,Jab1/CSN5有着于CUL4B E3泛素连接酶复合体中,但并没有与CUL4B蛋白直接意义。5)另外体内、外泛素化验证了Jab1/CSN5蛋白在CUL4B E3泛素连接酶有着的状况下发生多泛素化,提示CUL4B E3泛素连接酶通过影响Jab1/CSN5蛋白的多泛素化来调节蛋白的水平。综上所述,我们发现并证明了CUL4B E3泛素连接酶参与了Jab1/CSN5的多泛素化降解历程。第二部分干扰CUL4B基因表达导致BMP信号通路异常活化有探讨发现Jab1/CSN5可参与调节Smad7降解。Smad7蛋白是BMP (bone morphogenetic protein, BMP)信号通路的抑制性蛋白(Inhibitory Smads, I-Smads), Smad7蛋白的降解加快会使BMP通路异常活化。1)在HEK293细胞系中,干扰CUL4B表达后论文导读：上一页12
引起Jabl/CSN5的异常累积,而Smad7蛋白水平下降,并检测到磷酸化Smadl/5/8(pSmadl/5/8)蛋白水平上升；同时干扰CUL4B和Jab1/CSN5表达后发现Smad7和pSmad1/5/8蛋白水平基本恢复到对照组水平。这提示CUL4B E3泛素连接酶通过影响Jab1/CSN5,进而调节Smad7。21在HEK293细胞系中,干扰CUL4B基因表达后会引起BMP通路下游的靶基因的异常活化；同时干扰CUL4B和Jab1/CSN5基因表达后BMP通路下游靶基因的异常活化受到了抑制。这提示干扰CUL4B会引起BMP信号通路的异常激活。3)在Cul4b基因Cul4b条件性敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblasts, MEFs)中,发现Jabl/CSN5蛋白水平的异常累积；并检测到Smad7蛋白水平的降低从及pSmad1/5/8蛋白水平的升高；从及BMP信号通路下游靶基因Id1、Msx-2的异常活化。从上结果表明,干扰CUL4B基因表达后会引起BMP通路的异常活化,而这种活化可从通过同时干扰Jab1/CSN5基因表达来进行拯救；在Cul4b条件敲除小鼠的MEFs中也检测到了BMP信号通路下游靶基因的活化。第一部分和第二部分的结果证实：Jab1/CSN5是CUL4B E3泛素连接酶复合体的特异性底物；同时发现干扰CUL4B基因表达后会引起BMP信号通路的异常活化。从上结果对CUL4B突变导致的XLID致病机制的探讨提供了有价值的科学线索。关键词：CUL4B论文BMP论文Jab1论文泛素化降解论文X染色体连锁智力障碍综合征论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要6-9
Abstract9-13
符号说明13-14
前言14-20
第一部分 CUL4B E3泛素连接酶介导的Jab1蛋白泛素化降解20-57
材料与办法20-43
结果43-55
讨论55-57
第二部分 干扰CUL4B基因表达异常激活BMP信号通路57-70
材料与办法57-61
结果61-68
讨论68-70
结论70-71
参考文献71-79
致谢79-80
硕士期间发表的论文80-81
英文论文81-92
学位论文评阅及答辩状况表92
摘要：CUL4B基因是本探讨所于2007年采取定位候选克隆办法发现的一个X染色体连锁智力障碍(X-pnked intellectual disabipty, XLID)致病基因,随后本探讨所对该基因进行了一系列的分析与探讨。CUL4B基因属于Culpn基因家族,CUL4B C末端结合ROC1(RING-box protein1,ROC1);N末端结合DDB1(DNA damage binding1, DDB1),然后后共同组成Culpn-RING E3泛素连接酶复合体(Culpn-RING Ubiquitin Ligases, CRLs), CUL4B在这个复合体中起支架蛋白的意义。本实验室使用差别蛋白组学分析发现,当CUL4B蛋白表达水平变化后几点蛋白随之变化,例如：Peroxiredoxin Ⅲ (Prx Ⅲ)、Triosephosphate isomerase1、 Annexin A5、Jab1/CSN5(Jun activating binding protein, Jab1)等。Prx Ⅲ是CUL4B E3泛素连接酶的特异性底物蛋白,Prx Ⅲ可从清除细胞内的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)。CUL4B突变会抑制PrxⅢ降解,导致PrxⅢ累积,以而使细胞内ROS水平异常降低,最终导致神经干细胞分化异常。CUL4BE3泛素连接酶复合体选择性降解WDR5,以而影响神经元细胞的特殊基因转录活性,以而使神经体系正常的生理功能出现异常。CUL4B E3泛素连接酶复合体的特异性底物可能对高等动物的神经体系的正常发育有重要意义。因而探讨CUL4B E3泛素连接酶的特异性底物,不仅可从帮助我们更好地理解CUL4B基因的生物功能,更重要的是有助于揭示CUL4B突变导致XLID的致病机制。第一部分CUL4B E3泛素连接酶介导Jabl/CSN5的泛素化降解在哺乳动物体内,CUL4有CUL4B和CUL4A两个高度同源的蛋白,CUL4E3泛素连接酶复合体的构成形式是ROC1-CUL4-DDB1的复合体形式。CUL4B在N末端特有的149个氨基酸残基可能使其在底物选择方面与CUL4A有着差别。为了探讨CUL4B特异性底物从极为与CUL4B基因突变导致的XLID的联系,我们在HEK293(Human Embryonic Kidney293cells, HEK293)、HeLa从极为它细胞中使用RNAi干扰技术降低CUL4B蛋白表达水平,进而对其可能的底物进行了筛选,发现Jab1/CSN5蛋白是CUL4B E3泛素连接酶复合体的底物。1)在HEK293细胞中,干扰CUL4B的表达后,发现Jab1/CSN5的蛋白水平有一定程度的升高,同时我们检测到Jab1/CSN5蛋白半衰期异常延长,说明CUL4B可从调节Jabl/CSN5蛋白的稳定性。2)在HEK293细胞中,蛋白酶体抑制剂也会引起Jab1/CSN5蛋白水平的异常升高,说明Jab1/CSN5是经由26s蛋白酶体进行降解。31在HEK293细胞中,干扰ROC1或者DDB1的表达后,Jab1/CSN5蛋白水平有显著的升高且其半衰期显著延长；而当干扰CUL4A的表达后,并没有检测到Jabl/CSN5蛋白水平的升高从极为半衰期的变化。说明Jab1/CSN5的泛素化是由ROC1-CUL4B-DDB1复合体参与的。4)在HEK293细胞中,Jab1/CSN5有着于CUL4B E3泛素连接酶复合体中,但并没有与CUL4B蛋白直接意义。5)另外体内、外泛素化验证了Jab1/CSN5蛋白在CUL4B E3泛素连接酶有着的状况下发生多泛素化,提示CUL4B E3泛素连接酶通过影响Jab1/CSN5蛋白的多泛素化来调节蛋白的水平。综上所述,我们发现并证明了CUL4B E3泛素连接酶参与了Jab1/CSN5的多泛素化降解历程。第二部分干扰CUL4B基因表达导致BMP信号通路异常活化有探讨发现Jab1/CSN5可参与调节Smad7降解。Smad7蛋白是BMP (bone morphogenetic protein, BMP)信号通路的抑制性蛋白(Inhibitory Smads, I-Smads), Smad7蛋白的降解加快会使BMP通路异常活化。1)在HEK293细胞系中,干扰CUL4B表达后论文导读：上一页12
引起Jabl/CSN5的异常累积,而Smad7蛋白水平下降,并检测到磷酸化Smadl/5/8(pSmadl/5/8)蛋白水平上升；同时干扰CUL4B和Jab1/CSN5表达后发现Smad7和pSmad1/5/8蛋白水平基本恢复到对照组水平。这提示CUL4B E3泛素连接酶通过影响Jab1/CSN5,进而调节Smad7。21在HEK293细胞系中,干扰CUL4B基因表达后会引起BMP通路下游的靶基因的异常活化；同时干扰CUL4B和Jab1/CSN5基因表达后BMP通路下游靶基因的异常活化受到了抑制。这提示干扰CUL4B会引起BMP信号通路的异常激活。3)在Cul4b基因Cul4b条件性敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblasts, MEFs)中,发现Jabl/CSN5蛋白水平的异常累积；并检测到Smad7蛋白水平的降低从及pSmad1/5/8蛋白水平的升高；从及BMP信号通路下游靶基因Id1、Msx-2的异常活化。从上结果表明,干扰CUL4B基因表达后会引起BMP通路的异常活化,而这种活化可从通过同时干扰Jab1/CSN5基因表达来进行拯救；在Cul4b条件敲除小鼠的MEFs中也检测到了BMP信号通路下游靶基因的活化。第一部分和第二部分的结果证实：Jab1/CSN5是CUL4B E3泛素连接酶复合体的特异性底物；同时发现干扰CUL4B基因表达后会引起BMP信号通路的异常活化。从上结果对CUL4B突变导致的XLID致病机制的探讨提供了有价值的科学线索。关键词：CUL4B论文BMP论文Jab1论文泛素化降解论文X染色体连锁智力障碍综合征论文
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Abstract9-13
符号说明13-14
前言14-20
第一部分 CUL4B E3泛素连接酶介导的Jab1蛋白泛素化降解20-57
材料与办法20-43
结果43-55
讨论55-57
第二部分 干扰CUL4B基因表达异常激活BMP信号通路57-70
材料与办法57-61
结果61-68
讨论68-70
结论70-71
参考文献71-79
致谢79-80
硕士期间发表的论文80-81
英文论文81-92
学位论文评阅及答辩状况表92