阐述聚合物高分子纳米材料作为核酸和药物载体用于肿瘤治疗

论文导读：性质表明PC/Ada-PTX能有效结合DNA,形成粒径在200nm左右的球形结构,表面正电荷有利于与细胞膜表面相互意义。体外细胞实验表明PC/Ada-PTX/shRNA能携带药物和siRNA同时进入SKOV-3细胞中,并有效抑制survivin和Bcl-2基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。体内卵巢癌治疗结果显示协同运输紫杉醇和shRNA相对于单独利用紫杉醇或者shRNA对肿
摘要：高分子纳米材料作为药物/基因协同靶向给药体系是肿瘤治疗中是一种新的药物输送模式。通过引入功能基团提升高分子纳米材料的组织和细胞的靶向性,有效制约药物的释放,提升药物的生物使用度、增多安全性和治疗效果是肿瘤治疗的有效办法之一。阳离子聚合物由于其表面的正电荷,能有效与细胞膜相互意义,并且由于其表面易于修饰,可从携带基因／药物特异性在细胞和组织中高效表达而受到极大的专注。本文用p-环糊精(p-CyD)偶联低分子量的聚乙烯亚胺(PEI600)制备了阳离子聚合物PEI-CyD (PC),研究了阳离子聚合物携带基因进入细胞的途径及在细胞核转运的机制,考察了靶向短肽修饰的阳离子聚合物携载microRNA在胰腺肿瘤治疗中的疗效,评估了阳离子聚合物PC在化疗药物与小干扰RNA协同输送及减毒沙门氏菌介导的肿瘤免疫治疗中的积极意义。本文探讨的主要内容及结论如下：第一部分阳离子聚合物PC与质粒DNA形成的纳米颗粒通过表面的正电荷与细胞膜表面带负电的聚糖蛋白相互意义,在细胞膜表面集中,通过能量依赖的细胞吞噬途径进入细胞。PC携载基因进入细胞的途径主要是Clathrin-和Ceolae-依赖的细胞途径,两种途径形成的吞噬体汇聚到溶酶体中,由于PEI具有“质子海绵效应”导致溶酶体破裂,释放出质粒DNA。使用溶酶体抑制剂氯喹意义于溶酶体,发现溶酶体逃逸并不是影响PC基因转染的主要理由,细胞核转运是PC介导的基因转染的限制因素。通过共价和混合模式在聚阳离子材料PC上引入细胞核定位肽NLS,能有效提升分裂期和非分裂期细胞的基因转染效率。第二部分在聚阳离子材料PC上引入具有肿瘤细胞靶向和组织渗透性的短肽,与功能性1nicro-34a形成靶向纳米颗粒,并探讨了其体内外生物学性质及功能。CC9修饰的多功能纳米载体材料在体内外均体现出良好的肿瘤靶向功能,其携带miR-34a能有效提升PANC-1细胞和肿瘤组织中miR-34a的表达水平,并明显地抑制细胞周期和细胞迁移,诱导细胞凋亡。其转变细胞功能的分子机制主要是影响了PANC-1细胞中与细胞周期和细胞凋亡相关基因表达,如E2F3,Cycpn-D1,Bcl-2和C-Myc。体内实验结果表明,靶向多功能纳米载体材料携niR-34a能显著抑制胰腺肿瘤模型的生长并诱导肿瘤细胞的凋亡。第三部分将PC作为主体,金刚烷偶合紫杉醇(Ada-PTX)作为客体,主客体自组装形成超分子聚合物,协同运载化疗药物紫杉醇和survivin shRNA。超分子纳米聚合物理化性质表明PC/Ada-PTX能有效结合DNA,形成粒径在200nm左右的球形结构,表面正电荷有利于与细胞膜表面相互意义。体外细胞实验表明PC/Ada-PTX/shRNA能携带药物和siRNA同时进入SKOV-3细胞中,并有效抑制survivin和Bcl-2基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。体内卵巢癌治疗结果显示协同运输紫杉醇和shRNA相对于单独利用紫杉醇或者shRNA对肿瘤治疗具有显著的增敏效果。第四部分研究阳离子复合物PC/pDNA包被减毒沙门氏菌,形成一种新型的肿瘤免疫治疗的口服疫苗的可能性,探讨了其在体外免疫细胞中的吞噬及转运途径并对体内小鼠免疫原性进行评价。低剂量的阳离子聚合物包被减毒沙门氏菌对细胞活力影响较小,阳离子聚合物／沙门氏菌为2.5μg/1×106作为体外细胞学及体内的用量。阳离子聚合物包被的减毒沙门氏菌在免疫细胞小鼠单核巨噬细胞RAw264.7和小鼠腹腔巨噬细胞中的能够通过多种途径进入溶酶体,并以溶酶体中逃逸,提升外源蛋白的表达。体内实验结果显示,与单独的减毒沙门氏菌和阳离子复合物相比,复合物包被的减毒沙门氏菌能提升小鼠脾脏中CD3CD8细胞的数量,并降低对小鼠小肠的毒性。关键词：阳离子聚合物论文核转运论文miRNA论文超分子聚合物论文协同运输论文减毒沙门氏菌论文
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中文摘要5-7
Abstract7-9
中英文对照表9-10
目录10-16
第一章 绪论16-43

1.1 引言16

1.2 肿瘤的基因治疗16-21

1.2.1 抑癌基因治论文导读：料98-1004.2.1主要药品及试剂98-994.2.2仪器设备994.2.3细胞株994.2.4实验动物99-1004.3实验办法与步骤100-1054.3.1超分子纳米材料的制备1004.3.2超分子纳米材料的物理化学表征100-1014.3.2.1核磁共振波谱法(~1H-NMR)1004.3.2.2核欧佛豪瑟效应频谱(NOESYspectrum)100-1014.3.2.3傅里叶红外光谱(FourierTranor
疗16-17

1.2.2 RNA干扰治疗17-20

1.2.3 肿瘤免疫基因治疗20-21

1.3 纳米药物载体21-27

1.3.1 纳米药物载体的进展过程22-27

1.3.2 协同运输载体27

1.4 纳米药物载体转运机制27-32

1.4.1 细胞膜转运28-30

1.4.2 溶酶体逃逸30-31

1.4.3 细胞核转运31-32

1.5 本课题的提出32-33

1.6 参考文献33-43

第二章 阳离子聚合物携载基因进 #28入细胞途径的探讨43-72

2.1 引言43-44

2.2 材料与仪器44-46

2.1 材料和试剂44-45

2.2 实验仪器45-46

2.3 实验办法46-50

2.3.1 聚合物的合成46

2.3.2 细胞培养及转染46-48

2.3.3 质粒及材料的荧光标记48

2.3.4 细胞定位的激光共聚焦观察48-49

2.3.5 流式细胞仪检测细胞周期49

2.3.6 PC-NLS的合成及性质表征49-50

2.3.7 细胞毒性的检测50

2.3.8 数据统计学的分析(Statistical Analysis)50

2.4 实验结果及讨论50-67

2.4.1 PC作为基因载体转染条件的优化50-51

2.4.2 PC/DNA纳米复合物的细胞吞噬51-54

2.4.3 阳离子聚合物在CACO-2细胞中的定位及溶酶体逃逸54-56

2.4.4 细胞周期对阳离子聚合物基因转染效率的影响56-59

2.4.5 核定位信号肽对PC聚合物基因转染的影响59-67

2.5 本章小结67-68

2.6 参考文献68-72

第三章 双功能短肽修饰的阳离子纳米载体携载miRNA #57治疗胰腺肿瘤模型的探讨72-96

3.1 引言72-74

3.2 材料与仪器74-76

3.

2.1 主要药品及试剂74-75

3.

2.2 主要材料75

3.

2.3 仪器设备75

3.

2.4 细胞株75-76

3.

2.5 实验动物76

3.3 实验办法及步骤76-80

3.1 细胞吞噬的检测76

3.2 荧光定量PCR的检测76-77

3.3 流式细胞仪检测细胞周期77

3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡77-78

3.5 细胞迁移能力的测定78

3.6 PANC-1皮下肿瘤模型的建立78

3.7 体内靶向分布78

3.8 胰腺癌肿瘤模型的治疗78-79

3.9 ~(18)F-FDG micriPET显像技术79

3.10 Western Blot的检测79-80

3.11 肿瘤组织染色80

3.12 TUNEL染色80

3.13 统计学分析80

3.4 实验结果及讨论80-92

3.4.1 靶向纳米材料携带FAM-siRNA细胞吞噬81-83

3.4.2 靶向纳米材料提升肿瘤细胞中miR-34a的表达水平83-84

3.4.3 靶向纳米材料携载miRNA体外明显降低肿瘤细胞的增殖84-86

3.4.4 靶向纳米材料携载miRNA体外抑制肿瘤细胞的增殖的分子机制86-87

3.4.5 多肽修饰纳米材料体内靶向性探讨87-88

3.4.6 靶向修饰纳米材料携载miR-34a抑制胰腺癌模型的生长88-90

3.4.7 靶向修饰纳米材料携载miR-34a诱导胰腺癌细胞的调亡90-92

3.5 本章小结92-93

3.6 参考文献93-96

第四章 超分子纳米材料协同运载紫杉醇和survivin shRNA #81治疗乳腺癌的探讨96-125

4.1 引言96-98

4.2 仪器与材料98-100

4.

2.1 主要药品及试剂98-99

4.

2.2 仪器设备99

4.

2.3 细胞株99

4.

2.4 实验动物99-100

4.3 实验办法与步骤100-105
4.

3.1 超分子纳米材料的制备100

4.

3.2 超分子纳米材料的物理化学表征100-101

4.3.

2.1 核磁共振波谱法(~1H-NMR)100

4.3.

2.2 核欧佛豪瑟效应频谱(NOESY spectrum)100-101

4.3.2.3 傅里叶红外光谱(Fourier Tranormed Infrared Spectroscopy,FT-IR)101
4.

3.3 透射电镜形态观察101

4.

3.4 粒径和表面电势检测101

4.

3.5 琼脂糖凝胶电泳101

4.

3.6 药物释放动力学101-102

4.

3.7 胞吞噬的激光共聚焦检测102

4.

3.8 ShRNA-EGFP体外转染102

4.3论文导读：
.9 Western Blot102-103
4.

3.10 细胞周期的流式细胞仪检测103

4.

3.11 细胞凋亡的流式细胞仪检测103

4.

3.12 荧光定量PCR103-104

4.

3.13 细胞毒性检测104

4.

3.14 SKOV-3皮下肿瘤模型的建立104

4.

3.15 乳腺癌肿瘤模型的治疗104-105

4.

3.16 统计学分析105

4.4 实验结果及讨论105-120

4.1 超分子纳米材料的合成105-106

4.2 超分子纳米材料理化性质表征106-109

4.3 超分子纳米材料结合shRNA的能力109-110

4.4 超分子纳米材料药物释放动力学110

4.5 超分子纳米材料细胞吞噬和转染110-112

4.6 体外survivin shRNA和PTX对基因表达协同效果112-114

4.7 体外survivin shRNA和PTX对细胞增殖协同效果114-118

4.8 体内抑瘤效果118-120

4.5 本章小结120-121

4.6 参考文献121-125

第五章 阳离子聚合物包被减毒沙门氏菌作为肿瘤 #110免疫治疗的初步探讨125-148

5.1 引言125-127

5.2 实验材料127-128

5.

2.1 主要材料127

5.

2.2 细胞株127

5.

2.3 主要药品及试剂127-128

5.3 实验办法128-134
5.

3.1 减毒沙门氏菌培养128

5.

3.2 阳离子聚合物PC包被减毒沙门氏菌的制备128-129

5.

3.3 减毒沙门氏菌活力检测129

5.

3.4 扫描电镜形态观察129-130

5.

3.5 细胞吞噬130

5.

3.6 细胞透射电镜观察130

5.

3.7 小鼠腹腔巨噬细胞的分离提取130-131

5.

3.8 溶酶体染色实验131

5.

3.9 EGFP转染131-132

5.

3.10 小鼠脾脏单细胞悬液的制备132

5.

3.11 流式细胞仪检测T细胞132

5.

3.12 KDR质粒的构建132-134

5.4 实验结果及讨论134-144
5.

4.1 阳离子聚合物对沙门氏菌活力的影响134-135

5.

4.2 阳离子聚合物包被减毒沙门氏菌的形态学观察135-136

5.

4.3 阳离子聚合物包被减毒沙门氏菌在RAW267中细胞吞噬136-137

5.

4.4 阳离子聚合物包被减毒沙门氏菌在免疫细胞中的定位137-140

5.

4.5 阳离子聚合物包被提升减毒沙门氏菌基因转染效率140

5.

4.6 阳离子聚合物包被减毒沙门氏菌对T细胞增殖的影响140-143

5.

4.7 人VEGFR-2(KDR)真核表达载体的构建143-144

5.5 本章小结144-145

5.6 参考文献145-148

全文总结、创新点及未来的探讨方向148-151
全文结论148-149
主要创新点149
进一步方向149-150
展望150-151
攻读博士学位期间主要探讨成果151-152
发表的论文151
参编书籍151-152
致谢152