研讨耐高温耐高温α-淀粉酶基因工程菌构建及发酵条件

论文导读：
摘要：α-淀粉酶能水解淀粉的α-1,4糖苷键，是一种很重要的工业用酶。地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶是其中一种，因为它超强的耐热性和特殊的化学、pH稳定性，其被广泛的用于淀粉生产、酿造、烘焙、纺织、纸张制造从及生物燃料生产等工业生产的高温酶解历程。随着分子生物学的进展，随机突变、定点突变等办法已经被广泛地用于改进耐高温α-淀粉酶的特性，使其更适合工业生产。本论文针对前期构建的原核表达基因工程菌E.copBL21(DE3)-pET22b-amy和真核表达基因工程菌P.pastorisGS115-pPIC9-amy做了进一步的探讨，并全面对比两种基因工程菌的酶学特性，筛选出最佳基因工程菌株。对于原核表达基因工程菌E.copBL21(DE3)-pET22b-amy使用生物技术使耐高温α-淀粉酶基因α-AMY定点突变，得到酶学性质有所改进的突变酶。首先获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因片段α-AMY，将其与GeneBank中已有记录的地衣芽胞杆菌耐高温α-淀粉酶基因（登录号：A23402）序列进行同源性对比。经对比验证此地衣芽胞杆菌耐高温α-淀粉酶基因序列与A23402的基因序列同源性达到99.9%。将α-AMY连接于pMD-18T克隆载体上，对α-AMY基因片段中位于活性中心周围，参与酶催化反应的三个氨基酸位点Asp194，His235，Tyr302进行定点突变，使其分别突变为Ala194，Asp235，Asn302。将突变的α-AMY基因片段分别连接于表达载体pET-22b上，构建成三个不同的重组质粒pET-22b-α-AMY。再将重组质粒pET-22b-α-AMY转入E.cop BL21(DE3)中，高效表达酶蛋白。其次对突变酶蛋白的酶学性质进行测定，得到酶蛋白等电点均为5.5。Asp194Ala突变耐高温α-淀粉酶活力为236.3U/mL。His235Asp和Tyr302Asn突变耐高温α-淀粉酶活力分别为754.3U/mL和563U/mL。其中，His235Asp突变酶较其它两株突变酶更适合工业化生产。对于真核表达基因工程菌P. pastoris GS115-pPIC9-amy的发酵条件进行了探讨。利用四元线性回归正交设计探讨办法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型；得到最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL、摇床转速200r/min。在最优工艺条件下，发酵重组基因工程菌，此时耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。最后，测定此耐高温α-淀粉酶酶学性质：得出酶蛋白的等电点为5.8，耐受pH范围是4.0-10.0，最适pH是4.5-6.0，最适意义温度是80℃-90℃，且该酶在90℃时，20min后完全失去活性。全面对比几株突变原核表达基因工程菌和真核表达基因工程菌，所产耐高温α-淀粉酶的各种特性，几株基因工程菌的其它特性基本一致，其中突变株His235Asp所产耐高温α-淀粉酶活性最高。由此，筛选出His235Asp突变株是最适合工业化生产的基因工程菌。关键词：地衣芽孢杆菌论文耐高温α-淀粉酶论文定点突变论文酶学性质论文
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Abstract6-11
第1章 绪论11-21

1.1 α-淀粉酶概述11

1.2 耐高温α-淀粉酶的探讨发展11-16

1.3 耐高温α-淀粉酶的运用16

1.4 耐高温α-淀粉酶基因的克隆与表达16-17

1.5 耐高温α-淀粉酶的分子改造17-19

1.6 本论文主要探讨内容19-21

第2章 耐高温α-淀粉酶基因的定点突变及大肠杆菌中的表达21-42

2.1 材料与设备21-23

2.2 实验办法23-33

2.3 结果与分析33-40

2.4 讨论40

2.5 本章小结40-42

第3章 大肠杆菌表达耐高温α-淀粉酶性质的探讨42-50

3.1 材料与设备42

3.2 实验办法42-44

3.3 结果与分析44-47

3.4 讨论47-48

3.5 本章小结48-50

第4章 毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化50-59

4.1 材料与设备50-51

4.2 实验办论文导读：法51-524.3结果与分析52-574.4讨论57-584.5本章小结58-59第5章全文结论59-625.1总结59-605.2本论文创新点60-62参考文献62-72附录72-90导师介绍90-91作者介绍91-92攻读学位期间发表学术论文92-93致谢93-94上一页12
法51-52

4.3 结果与分析52-57

4.4 讨论57-58

4.5 本章小结58-59

第5章 全文结论59-62

5.1 总结59-60

5.2 本论文创新点60-62

参考文献62-72
附录72-90
导师介绍90-91
作者介绍91-92
攻读学位期间发表学术论文92-93
致谢93-94