试议下丘脑建立镇静催眠药临床前药效学评价策略和西红花有效成分催眠作用及机制怎样

论文导读：眠意义实验：术后动物恢复一周,移到记录笼适应三天,第四天开始记录24小时脑波作为基础值,第五天上午10：00将动物换到干净笼或其它动物呆过5天的脏笼,同时记录脑波,分析失眠小鼠睡眠觉醒行为特点。西红花素催眠意义实验前面步骤与模型相似,在第五天换干净笼前20分钟,腹腔注射溶剂或西红花素200或400mg/kg,记录24小时脑波。(5)神
摘要：目的：失眠已成为全球性日益严重的医学和社会不足。临床采取化学合成药治疗失眠,短期有效；长期利用,药物在增多睡眠量的同时,常伴有依赖性、耐受性和反跳性失眠等不良反应。临床资料显示,中药治疗失眠疗效好,不良反应少。然而,由于缺乏失眠动物模型及药物评价平台,中药治疗失眠缺乏科学依据。本探讨建立“新环境”钠处理小鼠催眠模型和“第一晚效应”失眠模型,使用高度自动化睡眠觉醒记录剖析体系,对传统中药西红花中的活性物质进行评价,并以睡眠觉醒相关脑区神经元活性和神经递质变化角度探索其意义机制。办法：(1)红外线检测小鼠自主活动实验：雄性C57BL/6J小鼠,共分5组,每组8只,第一天为自身对照日,20：00腹腔注射溶剂对照；第二天为给药日,20：00腹腔给受试药西红花醛(90、180或360mg/kg)、地西泮3mg/kg,1mg/kg氟马西尼+西红花醛(360mg/kg)。连续记录48小时,对比观察西红花醛对小鼠自主活动的影响及氟马西尼是否对抗西红花醛的意义。(2)钠处理小鼠翻正反射实验：雄性昆明种小鼠,共分10组,每组8-10只,下午13：00-19：00在恒温、恒湿、隔音室中进行。钠(45mg/kg)给药前半小时腹腔给溶剂或受试药西红花醛(90、180或360mg/kg)、地西泮3mg/kg,给予钠后观察小鼠翻正反射消失时间及恢复时间,计算药物对小鼠意义的睡眠潜伏期和睡眠时间。氟马西尼(1和3mg/kg)作为西红花醛机制探讨的假设对抗药,在西红花醛给药前20分钟腹腔注射,并设溶剂对照。(3)新环境钠处理小鼠(novel environment pentobarbital-treated mice, NV-PENT mice)西红花醛催眠意义实验：雄性C57BL/6J小鼠,头部手术安装电极恢复7天后,移置记录笼,连接睡眠记录体系。实验共分5组,每组5-6只,分别为溶剂对照、西红花醛(90、180或360mg/kg)、地西泮3mg/kg组。20：00灌胃给予上面陈述的药物,21：00腹腔注射钠(20mg/kg),连续记录24小时,观察药物对睡眠的影响。(4)第一晚效应失眠(first night effect insomnia, FNEI)小鼠模型建立及西红花素催眠意义实验：术后动物恢复一周,移到记录笼适应三天,第四天开始记录24小时脑波作为基础值,第五天上午10：00将动物换到干净笼或其它动物呆过5天的脏笼,同时记录脑波,分析失眠小鼠睡眠觉醒行为特点。西红花素催眠意义实验前面步骤与模型相似,在第五天换干净笼前20分钟,腹腔注射溶剂或西红花素200或400mg/kg,记录24小时脑波。(5)神经化学实验：动物给药分组同(3)行为学实验,给药后90分钟,10%水合氯醛麻醉断头处死,冰台上开颅取脑,迅速分离出皮层、海马、纹状体、脑桥、中脑、丘脑和下丘脑,分别称重,置-80℃冰箱冻存待测。组织匀浆、离心,取上清液用高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)检测。根据线性方程计算待测样品中各递质的含量。(6)免疫组织化学实验：给药办法同(2)或(4)行为学实验,小鼠给药90分钟后,10%水合氯醛麻醉开腹,生理盐水和4%多聚甲醛(PFA)灌注固定,取脑,免疫组化办法,观察c-Fos表达变化。结果：1.腹腔注射西红花醛90、180或360mg/kg可剂量依赖性降低小鼠自主活动,意义维持时间分别为2、4和7小时；苯二氮卓受体拮抗剂氟马西尼1mg/kg可拮抗高剂量西红花醛意义,西红花醛意义时间由7小时缩短为2小时。腹腔注射西红花醛90、180或360mg/kg可延长小鼠钠所致翻正反射消失时间,分别延长35%,68%和176%；氟马西尼3mg/kg可部分拮抗高剂量西红花醛意义。2.西红花醛90、180和360mg/kg灌胃NV-PENT小鼠可增多NREM睡眠量,意义维持时间分别为1、2和3小时；3小时NREM睡眠总量分别增多10.8%、62.6%和109.7%,对REM睡眠量无影响。对照组睡眠潜伏期为3.47分钟,180和360mg/kg西红花醛缩短NREM睡眠潜伏期至1.61分钟和1.86分钟,分别减少53.5%和46.5%；各剂量西红花醛或地西泮3mg/kg对REM睡眠潜伏期均无影响。180和360mg论文导读：
/kg西红花醛均可增多Delta波强度和慢波活动、睡眠转化次数,与阳性对照药地西泮降低能谱强度意义相反。180mg/kg西红花醛引起NREM睡眠平均持续时间减少,而90和360mg/kg西红花醛对其无影响。神经化学结果显示：与对照组对比,在NV-PENT小鼠皮层、纹状体和间脑,高剂量西红花醛除引起间脑多巴胺(Dopamine, DA)代谢产物3,4-双羟苯乙酸(3,4-dihydroxy-phenylacetic acid, DOPAC)增多外,儿茶酚胺类递质极为代谢产物无变化；在海马、中脑和下丘脑,西红花醛降低觉醒物质去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)水平；在海马、中脑、丘脑及下丘脑,DA代谢产物DOPAC或／和高香草酸(homovanilpc acid, HVA)升高,且中脑和丘脑(DOPAC+HVA)/DA比值增多。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平均有降低走势、其代谢物5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)有增多走势。在皮层、纹状体、中脑和下丘脑5-HIAA/5-HT比值增多,表明这些脑区5-HT觉醒物质代谢加快,可能是西红花醛催眠机制之一。免疫组化结果显示：与对照组对比,高剂量西红花醛可增多NV-PENT处理小鼠腹外侧视前区(ventrolateral preoptic nucleus, VLPO)中c-Fos蛋白表达,而下丘脑结节核(tuberomammillary nuclei, TMN)区c-Fos表达未见变化,表明西红花醛推动NREM睡眠主要通过活化VLPO区神经元发挥意义。3.小鼠FNEI模型是在白天动物睡眠高峰期,通过转变小鼠生活环境(脏笼和干净笼)给动物一定心理刺激引发小鼠失眠行为。结果显示：换脏笼或干净笼后,与基础值对比,动物觉醒量(或睡眠量)第1小时均增多(或减少),且增多(或减少)走势持续1-3小时；与脏笼相比,换干净笼睡眠觉醒各时间点、NREM/REM睡眠总量(6小时)均无差别,但觉醒总量增多。上面陈述的结果表明,换笼可增多小鼠觉醒量,导致一过性失眠,而笼子清洁度与小鼠失眠程度相关,清洁笼较脏笼易引起失眠。与换笼前基础值对比,换笼(干净或脏笼)均可致小鼠NREM睡眠强度增多、睡眠转化次数减少、片段化程度降低。然而,换笼清洁程度仅引起小鼠睡眠强度增多,而睡眠转化次数、平均发生持续时间无明显差别,即与片段化发生无显著相关性。4.小鼠FNEI模型对西红花素催眠意义的评价：与对照组对比,腹腔注射西红花素200mg/kg对FNEI小鼠睡眠觉醒量、睡眠潜伏期和慢波活动均无影响;NREM睡眠Delta波能谱增多；睡眠转化次数无影响、仅引起微小觉醒次数增多。西红花素400mg/kg注射后NREM和REM睡眠潜伏期分别减少34.58%和27.97%；各时间点NREM和REM睡眠有增多走势,觉醒量有减少走势,持续均达3小时,3小时NREM睡眠总量增多,伴随觉醒总量减少；Delta波能谱降低,慢波活动SWA2即频谱2.25-4Hz范围百分比降低；NERM睡眠和觉醒转化次数、睡眠觉醒片段发生次数增多,觉醒和NREM睡眠平均持续时间缩短,以而逆转FNEI小鼠睡眠片段化减少。这些结果表明,不同剂量西红花素对FNEI小鼠的睡眠量、深度和睡眠结构影响不同。低剂量不增多NREM睡眠量,较少影响睡眠结构,但可增多睡眠深度；而高剂量增多NREM睡眠量,睡眠深度降低,睡眠片段化。免疫组化结果显示：与对照组对比,西红花素可引起小鼠觉醒中枢蓝斑区c-Fos蛋白表达降低,表明该处所在的去甲肾上腺素神经元活性降低。而对睡眠中枢VLPO极为它觉醒中枢TMN等观察,未见c-Fos蛋白表达有显著变化。小结：1.西红花醛可降低小鼠自主活动、延长钠所致翻正反射消失时间,这些意义均可被苯二氮卓受体拮抗剂氟马西尼所对抗。2.西红花醛可增多NV-PENT小鼠NREM睡眠量,缩短NREM睡眠潜伏期；增多NREM睡眠强度、睡眠觉醒时相转化次数,减少睡眠片段平均持续时间或无变化。3.西红花醛可引起NV-PENT小鼠海马、中脑和下丘脑觉醒物质NE水平降低、DA代谢产物DOPAC或HVA升高；皮层、纹状体、中脑和下丘脑5-HIAA/5-HT比值增多；VLPO区c-Fo论文导读：
s蛋白表达增多,而TMN区c-Fos表达未见变化。4.换笼可致小鼠觉醒量增多,入睡时间延长,NREM和REM睡眠减少,睡眠维持困难,觉醒向NREM睡眠转化次数减少,伴NREM睡眠强度增多。与脏笼相比,换干净笼睡眠觉醒各时间点、NREM/REM睡眠总量(6小时)、睡眠转化次数、平均持续时间均无差别,但觉醒总量、NREM睡眠强度增多。5.西红花素可增多FNEI小鼠NREM睡眠量、缩短睡眠潜伏期、降低NREM睡眠Delta波能谱、增多睡眠觉醒时相转化次数；此意义可能通过降低觉醒脑区蓝斑去甲肾上腺素神经元的活性而实现。关键词：西红花醛论文西红花素论文钠论文催眠模型论文第一晚效应论文失眠模型论文睡眠觉醒论文自主活动论文翻正反射论文换笼论文新环境论文脑电图论文肌电图论文神经递质论文c-Fos论文免疫组化论文i苗效液相色谱-电化学法论文下丘脑腹外侧视前区论文下丘脑结节核论文蓝斑论文小鼠论文
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中文摘要7-11
Abstract11-16
前言16-20
材料与办法20-30

1. 材料20-22

1. 实验动物20

1.2. 主要药品20-21

1.

3. 主要仪器21-22

2. 办法22-30 2.

1. 小鼠自主活动的记录与剖析22-23

2.2. 小鼠头部、颈部EEG/EMG电极埋植手术23-24

2.3. 小鼠EEG/EMG数据记录、剖析24

2.4. 钠处理小鼠催眠模型的建立24-27

2.5. “第一晚效应”失眠小鼠模型的建立27

2.6. 神经化学法检测脑组织匀浆中神经递质的含量27-28

2.7. 免疫组织化学法检测Fos蛋白的表达28-29

2.8. 数据统计和分析29-30

实验结果30-45

1. 西红花醛镇静催眠意义的探讨30-32

1. 西红花醛降低小鼠自主活动30

1.2. 西红花醛延长小鼠钠所致翻正反射消失时间30-31

1.3. 西红花醛对夜间小鼠的睡眠-觉醒调节无显著影响31-32

2. PENT小鼠催眠模型的建立极为对西红花醛催眠意义的评价32-36
2.

1. 钠处理小鼠催眠模型的建立32

2.2. 西红花醛可调节NV-PENT小鼠睡眠觉醒周期32-34

2.3. 西红花醛对-PENT小鼠睡眠的影响34-36

3. 西红花醛对NV-PENT小鼠促睡眠意义机制的探讨36-39
3.

1. 神经化学办法对西红花醛催眠意义机制的探讨36-39

3.

2. 神经组织化学法对西红花醛催眠意义机制的探讨39

4. FNEI小鼠模型的建立极为对西红花素催眠意义的评价39-45

4.

1. FNEI小鼠的睡眠觉醒行为特点分析39-41

4.

2. 西红花素对FNEI小鼠催眠意义探讨41-43

4.

3. 西红花素催眠意义机制探讨43-45

结果图表45-74
讨论74-81
小结81-82
全文结论82
本探讨创新点82-83
参考文献83-87
综述

(一)：西红花有效成分的神经药理学探讨发展87-93

参考文献91-93
综述

(二)：睡眠办法学探讨发展93-107

参考文献102-107
博士期间已发表和待发表论文107-108
致谢108-109