研究抗原蛋白质精氨酸转移酶1在E3大鼠抗原诱导肺部炎症中作用机制

论文导读：
摘要：探讨作用和目的：支气管哮喘（以下简称哮喘）是一种由多种炎性细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等）浸润所致的反复发作的慢性气道炎症性疾病，临床上以气道高反应为特点，突出体现为可逆性的气道阻塞和发作性呼气性呼吸困难。近年来它的发病率不断上升，而成为严重影响人民健康的多发病。到现在为止，哮喘的发病机制仍未完全阐明，深入探讨哮喘发病历程中的生理生化历程，对于我们深入认识哮喘，寻找更有效的诊断与治疗哮喘的手段是必不可少的。抗原诱导的肺部炎症（antigen induced pulmonary inflammation，AIPI）大鼠模型，是一种经典的哮喘动物模型，它能良好的模拟哮喘的多种发病特点，尤其是哮喘的一个典型特点——肺部炎症。E3大鼠作为一种近交系大鼠，由于其对Th2型炎症的易感性，近年来逐渐开始用于哮喘模型的构建。但是E3大鼠哮喘模型的疾病特点及表型尚没有详尽的探讨。由此，我们第一步的探讨目的就是构建E3大鼠AIPI模型，观察不同的抗原刺激时长对大鼠哮喘模型各表型的影响。表观遗传修饰是指通过特定的酶修饰基因组DNA或构成染色质的蛋白，转变染色质的结构，调节靶基因的转录活性。表观遗传修饰参与包括细胞生长发育、分化、信号转导等多种生命历程。表观遗传修饰虽不涉及DNA序列的转变，但可被遗传。蛋白质精氨酸转移酶（PRMTs）可催化组蛋白等多种细胞蛋白发生精氨酸残基化，是一种近年来新发现的表观遗传修饰酶，在多种细胞进程中发挥着重要的调节作用。我们的探讨目标是确定参与E3大鼠AIPI模型的重要PRMT，并探寻PRMT1在IL-4诱导的嗜酸性细胞浸润历程中的作用机制。策略和结果：1.利用卵清蛋白（OVA）免疫并分别攻击E3大鼠1周、4周和8周，处死后分别观察肺病理变化、肺部炎症细胞浸润情况、血清中NO浓度、血清IgE和OVA特异性抗体及IL-4、TGF-β表达变化。结果显示无论是抗原刺激1周、4周还是8周，疾病组大鼠肺部均有显著的嗜酸性细胞浸润。抗原刺激1周组主要体现为肺部的炎症反应，如血清中NO水平的升高、迟发型超敏反应、肺IL-4表达水平的升高，炎症细胞的浸润等。而抗原刺激8周组大鼠以气道重塑为主要特点，如肺组织的破坏、胶原生成的增加、粘液分泌、抗体水平的升高、TGF-β的表达上升等。2. E3大鼠腹腔注射OVA/铝佐剂后鼻腔吸入OVA-PBS攻击构建AIPI模型；利用Real-time RT-PCR检测PRMT1-6、eotaxin-1和CCR3等的表达变化；利用PRMTs的广泛抑制剂AMI-1和小干扰RNA抑制A549细胞中PRMT1的功能；利用基因重组技术特异性的高表达A549肺上皮细胞中的PRMT1；对AIPI模型大鼠利用AMI-1进行干预后观察对哮喘炎症表型的影响。结果发现：PRMT1在AIPI大鼠的气道和肺泡上皮细胞表达显著升高；利用AMI-1抑制PRMTs的功能或敲低PRMT1的表达后可显著抑制IL-4刺激肺上皮细胞导致的eotaxin-1和CCR3表达转变；A549细胞转染重组质粒后特异性高表达PRMT1且下游基因eotaxin-1和CCR3水平升高；AIPI大鼠给与AMI-1治疗后能够显著降低肺部炎症、下调IL-4的表达和体液免疫反应，更为显著的是减轻肺部嗜酸性细胞的浸润。结论：1. E3大鼠AIPI模型的抗原刺激1周组具有急性炎症的普遍特点，可作为探讨急性肺部炎症的良好工具；同时，抗原刺激8周组具有慢性哮喘的显著特点，可用于慢性炎症导致的肺重塑的探讨。2. PRMT1在AIPI大鼠肺上皮细胞中显著上调，IL-4可刺激PRMT1表达水平的升高，干预PRMT1的活性可显著降低IL-4依赖的eotaxin-1的产生，以而影响嗜酸性细胞参与的肺部炎症历程。这些发现将为PRMT1在哮喘疾病中的作用机制探讨提供实验基础。关键词：哮喘论文大鼠论文抗原诱导的肺部炎症论文蛋白质精氨酸转移酶论文白细胞介素4论文eotaxin-1论文
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ABSTRACT5-15
1 绪论15-44
1.1 哮喘概述1论文导读：细胞、单核细胞、巨噬细胞计数482.4.5肺组织病理观察48-492.4.6PAS染色评估粘液分泌情况492.4.7Masson染色评估胶原生成情况49-502.4.8ELISA策略检测血清中IgE和OVA特异的IgG1抗体的含量502.4.9组织中RNA的提取50-522.4.10反转录522.4.11实时定量PCR（Real-timePCR）52-532.4.12统计浅析532.5实验结果53-572.5.1模型
5-18

1.1 气道炎症15-17

1.2 气道高反应性17-18

1.2 哮喘动物模型18-21

1.2.1 大鼠哮喘动物模型19

1.2.2 小鼠哮喘动物模型19-20

1.2.3 其他物种的哮喘动物模型20

1.2.4 动物模型的制备20-21

1.2.5 哮喘动物模型的局限性21

1.3 参与哮喘的相关因子21-28

1.3.1 细胞因子和趋化因子概述22-23

1.3.2 IgE相关的细胞因子23-24

1.3.3 嗜酸性细胞相关的细胞因子24-25

1.3.4 重塑相关的细胞因子25-27

1.3.5 趋化因子27-28

1.4 表观遗传调控28-33

1.4.1 DNA化29-30

1.4.2 组蛋白修饰30-31

1.4.3 非编码RNA31

1.4.4 表观遗传修饰与哮喘31-33

1.5 染色质重塑33-36

1.5.1 Swi2∕Snf2相关的染色质重塑复合物34

1.5.2 ISWI染色质重塑复合物34-35

1.5.3 Mi相关的染色质重塑复合物35

1.5.4 INo80复合物35-36

1.6 组蛋白化和蛋白质精氨酸转移酶36-41

1.6.1 组蛋白化36

1.6.2 蛋白质精氨酸转移酶36-40

1.6.3 不同PRMTs在转录调节及DNA修复中的角色40-41

1.7 组蛋白修饰与哮喘41-43

1.8 本探讨的目的与作用43-44

2 不同抗原攻击时长AIPI模型的构建和表型鉴定44-60

2.1 引言44

2.2 实验动物44-45

2.3 试剂和仪器45-47

2.3.1 主要试剂45

2.3.2 主要溶液的配制45-46

2.3.3 主要仪器46-47

2.4 实验策略47-53

2.4.1 实验前准备47

2.4.2 AIPI模型的制备策略47

2.4.3 迟发型超敏反应（DTH）47-48

2.4.4 BALF中总细胞及嗜酸性细胞、单核细胞、巨噬细胞计数48

2.4.5 肺组织病理观察48-49

2.4.6 PAS染色评估粘液分泌情况49

2.4.7 Masson染色评估胶原生成情况49-50

2.4.8 ELISA策略检测血清中IgE和OVA特异的IgG1抗体的含量50

2.4.9 组织中RNA的提取50-52

2.4.10 反转录52

2.4.11 实时定量PCR（Real-time PCR）52-53

2.4.12 统计浅析53

2.5 实验结果53-57

2.5.1 模型的建立及分组53

2.5.2 嗜酸性细胞浸润在不同的刺激时长普遍有着53-55

2.5.3 炎症反应是抗原刺激初期的主要反应55

2.5.4 气道和肺泡结构重塑和胶原生成增加为长期抗原刺激后的主要反应55-56

2.5.5 体液免疫是抗原刺激历程中保持稳定变化56-57

2.6 讨论57-60

3 PRMT1调控肺上皮细胞中IL-4诱导的eotaxin-1的表达60-85

3.1 引言60-61

3.2 实验动物61

3.3 主要试剂及溶液配制61-64

3.1 试剂61-62

3.2 主要溶液的配制62-64

3.4 主要仪器64

3.5 实验策略64-70

3.5.1 大鼠AIPI模型的构建64

3.5.2 总RNA提取、反转录及实时定量PCR64-66

3.5.3 免疫组化66

3.5.4 细胞培养66-67

3.5.5 细胞刺激及转染67-68

3.5.6 pcDNA1-PRMT1重组质粒的构建及转染68-69

3.5.7 蛋白的提取以及western blot69

3.5.8 统计浅析69-70

3.6 结果70-83

3.6.1 PRMTs在AIPI大鼠肺及脾脏组织中的表达转变70

3.6.2 PRMTs各亚型表达于哮喘表型指标相关性浅析70-71

3.6.3 PRMT1在AIPI大鼠肺组织中的表达转变最为显著71-72

3.6.4 IL-4刺激上皮细胞后PRMT1和eotaxin-1表达显著升高并呈现时间和剂量依赖性72-74

3.6.5 抑制上皮细胞中PRMT1可调节eotaxin-1的表达74-77

3.6.6 高表达上皮细胞中PRMT1可上调eotaxin-1及CCR3的表达77

3.6.7 AMI-1可抑制AIPI大鼠肺eotaxin-1和CCR3的表达并减轻嗜酸性细胞的浸润77-78

3.6.8 AMI-1治疗能够显著降低肺部炎症78-83

3.7 讨论83-85

4 结论与展望85-87

4.1 结论85

4.2 展望85-87

参考文献87-100
致谢100-102
攻读学位期间取得的探讨成果102-104