谈述酪氨酸EGF诱导Src信号动力学实时光学成像封面

论文导读：Kinases,PTKs）与蛋白质酪氨酸磷脂酶（ProteinTyrosinePhosphatases,PTPs）的相互拮抗，所以一个特定蛋白质的酪氨酸磷酸化水平是PTKs和PTPs共同作用的结果。最近探讨发现酪氨酸磷酸化历程受双氧水(HydrogenPeroxide,H_2O_2)介导的氧化还原历程调节。证据显示H_2O_2可以通过氧化PTPs活性中心的半胱氨酸残基而抑制其活性。
摘要：蛋白质酪氨酸磷酸化对诸多基本细胞历程起着关键的调控作用，包括细胞生长、粘附、增殖等。因为蛋白质酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases, PTKs）与蛋白质酪氨酸磷脂酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）的相互拮抗，所以一个特定蛋白质的酪氨酸磷酸化水平是PTKs和PTPs共同作用的结果。最近探讨发现酪氨酸磷酸化历程受双氧水(Hydrogen Peroxide, H_2O_2)介导的氧化还原历程调节。证据显示H_2O_2可以通过氧化PTPs活性中心的半胱氨酸残基而抑制其活性。目前逐渐形成有关H_2O_2在生长因子诱导的酪氨酸磷酸化信号中的作用的假说：PTKs的激活不足以提升蛋白质的酪氨酸磷酸化稳态水平，同时也需要内源性H_2O_2介导的PTPs抑制作用的参与。虽然H_2O_2参与酪氨酸磷酸化信号通路的分子机制已经被广为接受，但是H_2O_2是以何种方式调节酪氨酸磷酸化信号动力学历程及其特点仍不清楚，尤其是缺乏活细胞内的实时动态调节信息；此外，在外源性H_2O_2诱导的氧化应激中，细胞内谷胱甘肽（Glutathione, GSH）氧化还原电势与酪氨酸磷酸化动力学之间的联系至今未见报道。本探讨利用基于荧光蛋白的荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance EnergyTraner, FRET）探针Src探针在活细胞水平对上表皮生长因子（Epidermal GrowthFactor, EGF）诱导的和Src激酶介导的酪氨酸磷酸化历程（简称Src信号）进行了定量探讨，发现内源性H_2O_2通过抑制PTPs活性，正向地调节Src信号的峰值强度和持续时间。为了在单个细胞内对Src信号动力学与外源性H_2O_2诱导的细胞GSH氧化还原电势变化动力学进行同步探讨，我们进展了基于mVenus/mKOκ FRET对的Src探针和基于单个荧光蛋白的Grx1-roGFP2探针的双分子成像策略，在单个细胞中，实现了Src信号和氧化还原电势信号动力学变化的实时同步成像。探讨显示，在外源性H_2O_2诱导下，细胞内GSH氧化还原系统参与负调节EGF诱导的Src信号。主要探讨结果如下：1）活细胞内，在EGF刺激下，利用Src光学探针，我们得到了Src信号动力学。结果显示Src信号动力学曲线与用生化策略得到的EGF诱导的细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase, ERK）信号动力学曲线类似，通过借鉴用来描述ERK动力学的数学模型和参数，我们引入三个简化的参数来定量描述Src信号动力学：信号峰值、信号持续时间和积分信号强度。并建立了这三个参数与Src活化程度和PTPs活性之间的关联。2）在活细胞内，发现内源性H_2O_2通过抑制PTPs活性来调节Src的信号峰值和持续时间。通过细胞内表达H_2O_2相关调节基因Rac1-N17和Prx1-Y197F，降低内源H_2O_2水平，结果显示Src的信号峰值和持续时间均大大降低。而PTPs特异抑制剂vanadate能够消除此影响。3）结果提示EGF诱导的内源性H_2O_2必须局部产生，这样可以避开触发细胞抗氧化防御机制。动力学数据显示这个防御机制不利于Src介导的酪氨酸磷酸化信号。4）进展了基于荧光蛋白mVenus和橙色荧光蛋白mKOκ的新FRET对，建立了基于mVenus/mKOκ (简称YO) FRET对和单荧光蛋白探针Grx1-roGFP2的双比率实时同步成像新策略。实验结果显示，在进行多色荧光信号双比率实时成像时，无需特殊的算法处理，即可获得双生物分子信号互不干扰的动态信息。5）设计了基于YO FRET对的Src激酶探针：YO-Src。在单细胞内，对YO-Src和Grx1-roGFP2探针进行同步成像，结果显示，外源H_2O_2对EGF诱导的Src信号起负向调节作用。本论文，以可视化、定量化的实验策略，在活细胞水平，显示了EGF诱导的Src信号动力学。阐明了内源性和外源性H_2O_2在Src信号动力学中的作用特点，同时增进了对信号分子H_2O_2在细胞中重要作用的理解。本论文建立的荧光信号定量表征分子事件的探讨策略，也适用于其它信号途径中分子事件的探讨；建立的双比率成像策略，可以广论文导读：讨论874.5本章小结87-885总结与展望88-925.1本论文主要探讨结果88-895.2本论文主要革新点895.3展望89-92致谢92-94参考文献94-109附录攻读学位期间发表的论文目录109上一页12
泛地运用到细胞信号转导途径双分子事件时空特性描述中。关键词：蛋白质酪氨酸磷酸化论文荧光蛋白探针论文荧光能量共振转移成像论文双氧水论文多分子事件成像论文
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Abstract6-11
1 绪论11-28

1.1 蛋白质酪氨酸磷酸化介绍11-15

1.2 双氧水（H_2O_2）在蛋白质酪氨酸磷酸化中的作用15-16

1.3 检测 Src 和 H_2O_2的荧光蛋白探针16-23

1.4 基于荧光蛋白的多分子成像策略23-24

1.5 选题背景及本论文探讨的主要内容24-28

2 内源性 H_2O_2在 EGF 诱导的 Src 信号中的调节作用28-62

2.1 引言28-29

2.2 材料和策略29-44

2.3 实验结果44-58

2.4 讨论58-61

2.5 本章小结61-62

3 基于 mVenus/mKOκ FRET 探针和单荧光蛋白探针 Grx1-roGFP2 的双分子事件成像新策略62-81

3.1 引言62-65

3.2 材料和策略65-70

3.3 实验结果70-79

3.4 讨论79-80

3.5 本章小结80-81

4 Src 信号和 GSH 氧化还原电势的同步成像81-88

4.1 引言81-82

4.2 材料和策略82-83

4.3 实验结果83-87

4.4 讨论87

4.5 本章小结87-88

5 总结与展望88-92

5.1 本论文主要探讨结果88-89

5.2 本论文主要革新点89

5.3 展望89-92

致谢92-94
参考文献94-109
附录 攻读学位期间发表的论文目录109