研讨球菌猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗构建及免疫原性评价

论文导读：养猪业比较严重的疾病,给世界养猪业造成巨大的经济损失。由于其病毒的致病特点,使目前的商品化疫苗有着着缺陷,不能完全阻止经呼吸系统及胎盘传播猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)。鉴于此,本探讨结合PRRSV的致病特点、免疫特性及生物学特性探讨性的设计黏膜免疫新型疫苗
摘要：黏膜免疫系统是人和动物机体整个免疫网络的重要组成部分,又是具有独特结构和功能的独立免疫系统,在抵抗感染方面起着积极重要的作用。首先,黏膜表面与外界抗原(主要指病原微生物)接触,是机体抵抗感染的第一道防线；其次,黏膜免疫系统具有共同黏膜免疫共享机制,这一机制能将全身黏膜免疫状态达成一致；再次,黏膜免疫可同时诱发黏膜免疫和系统免疫应答。由此,黏膜免疫日益受到重视,转变免疫对策,设计黏膜免疫疫苗,对预防传染病的发生具有重要作用,也是传染病预防领域的新技术热点之一猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)一直是危害世界养猪业比较严重的疾病,给世界养猪业造成巨大的经济损失。由于其病毒的致病特点,使目前的商品化疫苗有着着缺陷,不能完全阻止经呼吸系统及胎盘传播猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)。鉴于此,本探讨结合PRRSV的致病特点、免疫特性及生物学特性探讨性的设计黏膜免疫新型疫苗,对预防该病具有重要作用。试验选取PRRSV的ORF6基因作为目的基因,乳酸乳球菌乳链菌肽制约表达(nisin controlled expression, NICE)系统为抗原递呈载体,构建重组乳酸乳球菌活载体疫苗,并对其免疫反应原性及佐剂效力进行评价。主要探讨工作和结果如下：1、试验将PRRSV经Marc-145细胞培养后,进行RT-PCR扩增,获得大小为515bp的抗原基因ORF6,将其克隆到PMD19-T载体后测序,核苷酸序列未发生变异。根据测序结果和乳酸乳球菌表面表达载体PNZ8149特点,设计引物,扩增并纯化出两端含有Sac Ⅰ和NcoⅠ酶切位点的PRRSV的ORF6基因片段,将纯化后的ORF6基因与表达载体pNZ8149进行连接,连接产物采取电转化策略将其转入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞中构建重组菌,命名为PNZ8149/NZ3900-M/PRRS。进一步对PNZ8149/NZ3900-M/PRRS进行诱导,诱导剂乳链杆菌肽(Nisin)添加量为10ng/mL诱导时间分别为2h、4h、6h、8h、10h和12h, SDS-PAGE浅析,在19KD处出现了预期的条带,表达了分子量为19KD的蛋白,诱导6h条带比较清晰,是最佳的诱导时间。间接免疫荧光实验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面且具有反应原性。试验结果表明,成功构建了以乳糖为选择标记的食品级重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS,为开发PRRSV的乳酸乳球菌黏膜免疫疫苗奠定了论述基础。2、将构建的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫BALB/c小鼠,将小鼠随机分成4组(n=30),组Ⅰ鼻腔免疫PBS缓冲溶液,为空白对照组；组Ⅱ鼻腔免疫空载体菌株培养液,为载体对照组；组Ⅲ鼻腔免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS悬浮菌液,为鼻腔免疫实验组；组Ⅳ口服免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS悬浮菌液,为口服免疫实验组。各组试验动物被连续免疫(即：1d,2d,3d,11d、,12d,13d,21d,22d,23d),免疫剂量为50ul,悬浮菌液细菌含量为1×1011CFU/mL。试验动物在最后一次免疫后0d、7d、14d、21d、28d分别被处死,每次每组处死6只,取血液、肠粘液、呼吸道冲洗液检测抗体,采取间接ELISA策略检测血清中特异性IgG和黏膜中s-IgA抗体含量,评价其动态变化情况,并在最后一次免疫后14d取脾脏进行细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10IFN-γ等活性检测。重组乳酸乳球菌经口服免疫和鼻腔免疫后均能刺激黏膜分泌特异性s-IgA,在整个免疫测定期间内,两试验组在呼吸道黏膜及消化道黏膜产生的特异性s-IgA抗体水平均极显著高于PBS对照组和载体对照组((P0.01),两试验组间滴鼻免疫试验组高于口服试验组,且呼吸道黏膜s-IgA抗体水平差别极显著((P0.01),消化道黏膜s-IgA抗体水平差别不显著(P0.05)。在整个测定期间内粘膜抗体s-IgA保持稳定走势,可能由于抗体测定时间比较迟或测定周论文导读：
期相对较短；同时在最后一次免疫后14天检测小鼠脾细胞悬液IL-5的活性,重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫组显著高于对照组,差别极显著(p0.01),口服免疫组和滴鼻组无显著差别(p0.05),IL-5的活性对黏膜免疫的调节起重要作用,协同其它细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-6等)刺激B细胞的增殖与分化,推动活化的B细胞分化成IgA+B细胞,合成分泌型IgA。重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫小鼠后,两试验组脾细胞悬液中IL-2和IFN-γ与对照组差别极显著(p0.01),滴鼻免疫组IL-2和IFN-γ水平高于口服免疫组,滴鼻免疫实验组IL-2和IFN-γ水平分别达到349.848pg/ml和173.276pg/ml,口服免疫实验组IL-2和IFN-γ水平分别达到335.455pg/ml和162.91g/ml；IL-4水平在各组之间差别不显著(p0.05),但滴鼻免疫实验组略高于口服实验组,分别为21.466pg/ml和19.799pg/ml。重组菌试验组血清中特异性IgG抗体水显著高于PBS对照组和载体对照组,差别极显著((P0.01)；鼻腔免疫组抗体水平在最后一次免疫后7天达到最高,在整个测定时间内维持在高水平,口服免疫组抗体水平在最后一次免疫后21天达到最高水平,然后迅速下降。以上结果表明,重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS经口服及鼻腔免疫后,能诱导产生粘膜免疫反应,并同时激发Thl型系统免疫应答,即体液免疫和细胞免疫应答,并且滴鼻免疫途径优于口服免疫途径。3、将构建的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS抗原与黏膜佐剂CpG ODN联合鼻内免疫BALB/c小鼠,评价其佐剂效应。试验选取BALB/c小鼠90只,随机分为3组(n=30),分别为重组菌对照组(组Ⅰ)、佐剂+重组菌实验组(组Ⅱ)和佐剂对照组(组Ⅲ),佐剂免疫剂量每只小鼠为10ug,重组菌免疫剂量、免疫策略及检测指标同第二部分试验。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清特异性抗体IgG高于单独佐剂组和抗原组,呼吸道和肠道黏膜s-IgA水平高于单独佐剂组和抗原组,并且呼吸道黏膜s-IgA抗体水平高于肠道黏膜抗体；最后一次免疫后14天检测脾细胞悬液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5的活性。IL-2、IFN-γ和IL-5的活性佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组高于单独抗原组(p0.05),显著高于单独佐剂组(P0.01)；IL-4水平在各组之间差别不显著(p0.05)。结果表明CpG ODN能协同重组菌提升小鼠黏膜免疫和系统免疫反应,为探讨安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。关键词：黏膜免疫论文乳酸乳球菌论文NICE系统论文猪繁殖与呼吸综合征论文ORF6论文
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ABSTRACT12-17
第一篇 文献综述17-60
第一章 黏膜免疫系统及疫苗17-26
1 黏膜免疫不同于系统免疫的特点17-20

1.1 黏膜免疫系统的组成17-18

1.2 黏膜免疫系统独立的结构系统18

1.3 黏膜免疫应答18-19

1.4 S-IGA功能19

1.5 共同黏膜免疫机制19-20

1.6 免疫反应20

2 黏膜免疫系统的运用20-26

2.1 黏膜免疫疫苗开发近况20-24

2.

1.1 呼吸道黏膜疫苗20-21

2.

1.2 肠道黏膜疫苗21-24

2.

1.3 生殖道黏膜疫苗24

2.

1.4 寄生虫黏膜免疫疫苗24

2.2 黏膜免疫疫苗的接种途径24-26
第二章 黏膜免疫抗原递呈活载系统统-NICE系统26-33
1 黏膜免疫抗原递呈载体26
2 乳酸菌与黏膜免疫26-27
3 基因工程乳酸菌抗原递呈系统27-33

3.1 基因工程乳酸菌表达载体类型27-29

3.

1.1 组成型表达载体28

3.

1.2 诱导型表达载体28-29

3.2 乳酸菌乳链菌肽诱导表达系统29-33
3.

2.1 乳酸菌NICE系统的构成29-30

3.

2.2 NICE系统的优点30-31

3.

2.3 NICE系统作为黏膜疫苗抗原递呈活载体的运用3论文导读：

1
3.

2.4 有着的不足及展望31-33

第三章 黏膜免疫佐剂33-40
1 细菌性物质33-38

1.1 细菌毒素33-35

1.1 CT和LT作为黏膜佐剂的运用34-35

1.2 CPG ODN序列35-38

1.2.1 CpG ODN作用机理35-36

1.2.2 CpG ODN佐剂的运用近况36-38

2 细胞因子38-39
3 抗原传递系统39-40
第四章 猪繁殖与呼吸综合征探讨进展40-58
1 病原学特点40-51

1.1 分类地位及生物学特性40-42

1.2 病毒血凝性42

1.3 PRRSV基因组成及其编码的蛋白功能42-51

1.3.1 非编码区(5'NCR、3’NCR)和复制酶基因(ORFla、ORFlb)42-43

1.3.2 结构蛋白基因及其编码的蛋白质43-51

1.3.2.1 非主要结构蛋白43-45

1.3.2.2 主要结构蛋白45-51

2 PRRSV的危害51-56

2.1 抗体依赖性增强作用51-55

2.

1.1 ADE作用的机制52-54

2.

1.2 PRRSV的ADE的危害54-55

2.2 病毒的持续性感染和继发感染55

2.3 病毒的高度变异性55-56

3 PRRSV的免疫56-58

3.1 商品化疫苗的局限性56

3.2 PRRSV免疫对策56-58

第五章 探讨的目的及作用58-60
第二篇 探讨部分60-101
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因表达载体的构建60-82
1 试验材料60-63

1.1 病毒、细胞60

1.2 载体及菌株60-61

1.3 工具酶及主要试剂61

1.4 主要溶液配制61-63

1.4.1 病毒培养液61-62

1.4.2 细菌培养基62

1.4.3 感受态细胞制备及转化所用溶液62

1.4.4 诱导剂Nisin处理62-63

1.5 主要仪器设备63

2 试验策略63-73

2.1 PRRSV ORF6基因提取纯化63-65

2.

1.1 引物设计合成63

2.

1.2 病毒扩增及总RNA提取63-64

2.

1.3 cDNA的合成64

2.

1.4 ORF6基因的扩增64-65

2.

1.5 琼脂糖凝胶电泳检测65

2.

1.6 靶基因的纯化回收65

2.2 克隆载体PMD19-T-M的构建65-67

2.1 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备65

2.2 连接转化65-66

2.3 质粒提取及鉴定66-67

2.4 测序67

2.3 表达PRRSV ORF6基因菌体的构建67-71

2.3.1 表达PRRSV ORF6基因大肠杆菌的构建67-69

2.3.2 表达PRRSV ORF6基因乳酸乳球菌的构建69-71

2.4 基因工程重组菌的诱导表达71-73

2.4.1 pET32a-M/PRRSV诱导表达及蛋白含量测定71-72

2.4.2 PNZ8149/NZ3900-M/PRRS诱导表达72-73

2.5 免疫活性检测73

2.

5.1 PNZ8149/NZ3900-M/PRRS诱导后产物间接免疫荧光浅析73

3 结果浅析73-79

3.1 克隆载体PMD19T-M/PRRSV的构建73-74

3.

1.1 PMD19-M/PRRSV的鉴定73

3.

1.2 PMD19-M/PRRSV中ORF6基因测序鉴定73-74

3.2 大肠杆菌表达系统的构建74-76
3.

2.1 pET32a-M/PRRSV的鉴定74-75

3.

2.2 M蛋白在大肠杆菌中的诱导表达75

3.

2.3 M蛋白的纯化及含量测定75-76

3.3 乳酸乳球菌表达系统的构建76-79

3.1 重组质粒PNZ8149/NZ3900-M/PRRS的鉴定76-77

3.2 M蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达77-79

4 讨论79-81

4.1 PRRSV M蛋白的表达79-80

4.2 乳链菌肽诱导表达(NICE)系统的选择80-81

5 小结81-82
第二章 重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫原性检测82-101
1 试验材料82-83

1.1 试验动物82

1.2 免疫原82

1.3 主要试剂82-83

1.4 主要溶液配制83

1.5 主要仪器设备83

2 试验策略83-87

2.1 试验动物选择及处理83-84

2.2 免疫用试验材料的制备84

2.1 免疫原制备84

2.2 PNZ8149/NZ3900空载体菌液制备84

2.3 样品采集及指标检测策略84-87

2.

3.1 免疫鼠黏膜中s-IgA论文导读：

检测84-85

2.3.2 免疫鼠血清中特异抗体IgG检测85

2.3.3 细胞因子(Cytokines)检测85-87

3 结果与浅析87-94

3.1 血清特异性抗体IGG87-89

3.2 黏膜抗体s-IGA89-92

3.

2.1 肠黏膜s-IgA89

3.

2.2 呼吸道黏膜s-IgA89-92

3.3 细胞因子92-94
3.3.1 细胞免疫评价因子IL-

2、IL-4及IFN-γ92

3.3.2 黏膜淋巴因子IL-592

3.3 黏膜免疫耐受因子IL-1092-94

4 讨论94-99

4.1 重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS诱导的免疫反应94-96

4.

1.1 黏膜免疫应答94-95

4.

1.2 系统免疫应答95-96

4.2 黏膜免疫耐受96

4.3 黏膜免疫接种途径96-98

4.4 PRRSV感染的预防机制98-99

5 小结99-101
第三章 CPG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/C小鼠的佐剂效应101-111
1 试验材料101-102

1.1 试验动物101

1.2 佐剂及免疫原101

1.3 主要试剂及仪器101-102

2 试验策略102

2.1 试验动物的选取及处理102

2.2 免疫用试验材料的制备102

2.3 样品采集及指标检测策略102

3 结果与浅析102-108

3.1 血清IGG抗体102-103

3.2 肠黏膜S-IGA103

3.3 呼吸道黏膜S-IGA103-107

3.4 细胞因子107-108

4 讨论108-109
5 小结109-111
第三篇 结论及革新点111-113
1 结论111
2 革新点111-113
参考文献113-126
作者介绍126
攻读学位期间发表论文126-127
致谢127