火焰卫矛组织培养再生体系优化及遗传转化探讨

论文片段—382.1火焰卫矛无菌诱导培养28-2912下一页火焰卫矛论文,再生论文,组织培养论文,农杆菌论文,遗传转化论文,
摘要：火焰卫矛(Euonymus alatus 'compacta')属于卫矛科落叶灌木,因其叶片里火焰红色而具有的园艺观赏和经济价值,每株成熟的火焰卫矛每年能生产成百上千粒种子。鸟类和流水的传播,火焰卫矛在美国非常流行,不可控制,破坏其他植物区系,严重威胁生态平衡。本研究以火焰卫矛为研究对象,优化了植株组织培养再生体系,并在此基础上探索农杆菌介导火焰卫矛遗传转化技术,为利用基因工程技术对火焰卫矛遗传改良打下了基础。主要研究结果如下:(1)火焰卫矛植株组培再生体系优化本研究以火焰卫矛成熟胚培养长出的子叶、下胚轴为外植体组织培养及植株再生研究,优化了火焰卫矛组织培养再生体系。研究结果:成熟胚培养基为WPM+TDZ0.5mg·L~(-1);愈伤组织诱导培养基为WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽分化培养基为WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽增殖和壮苗培养基为WPM+6-BA4 mg·L~(-1);生根培养基为1/2MS+NAA0.2 mg·L~(-1)+AC0.5 g·L~(-1)。移栽基质为营养土,成活率为83.3%。(2)农杆菌介导火焰卫矛遗传转化体系建立以火焰卫矛子叶和下胚轴为转化受体遗传转化体系研究,确定了子叶和下胚轴不定芽分化的卡那霉素(kan)筛选压分别为60 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1);而在抑菌剂头孢霉素(cef)和特美汀(Timentin)浓度对比研究中发现,Timentin对不定芽分化的影响要小于头孢霉素(Cef)的影响,Timentin浓度为400 mg·L~(-1)时,子叶分化率达到23.89%,而Cef在相同浓度下子叶分化率仅为15.56%;并确定Timentin最佳抑菌浓度为200 mg·L~(-1)。探讨了遗传转化中外植体预培养时间、共培养时间、浸染菌液浓度和浸染时间对遗传转化效率的影响。结果,外植体预培养2 d,共培养3d,菌液浓度OD600为0.4～0.5,浸染6 min为最佳技术参数;在YEP液体培养基中添加100μmol·L~(-1)AS可提高转化率8.8%毕业论文答辩。(3)转基因植株筛选鉴定农杆菌介导法遗传转化火焰卫矛,并对转化植株GUS组织活性及PCR检测,证明由Barnase和iaaM组成的超级不育表达元件已经整合到火焰卫矛植株,从78株抗性植株中筛选出转基因植株3株论文范文格式。关键词：火焰卫矛论文再生论文组织培养论文农杆菌论文遗传转化论文
摘要7-8
Abstract8-10
章 文献综述10-26
1 木本观赏植物组织培养研究进展10-14

1.1 木本观赏植物离体培养研究现状10-11

1.2 木本观赏植物组织培养的应用11-12

1.2.1 离体繁殖11

1.2.2 单倍体育种11

1.2.3 原生质体培养和体细胞杂交11

1.2.4 体细胞无性系变异及突变体筛选11-12

1.2.5 植物的遗传转化12

1.3 影响木本观赏植物组织培养的因素12-14

1.3.1 培养基成分12-13

1.3.2 外植体的选择13

1.3.3 其它影响因素13-14

2 木本观赏植物基因工程研究进展14-17

2.1 木本观赏植物遗传转化特点14

2.2 木本观赏植物遗传转化方法14-16

2.1 叶盘法14-15

2.2 整体植株共感染法15

2.3 原生质体法15

2.4 体细胞或胚细胞的转化法15

2.5 真空渗入法15-16

2.3 木本观赏植物遗传转化的影响因素16-17

2.3.1 Vir基因的活化对遗传转化的影响16

2.3.2 外植体预培养对遗传转化的影响16

2.3.3 外植体共培养对遗传转化的影响16

2.3.4 选择压、抑菌剂对遗传转化的影响16

2.3.5 其他因素对遗传转化的影响16-17

3 植物雄性不育基因工程研究进展17-21

3.1 利用基因工程创造雄性不育植株的主要策略17-19

3.

1.1 特异表达细胞毒素基因创造雄性不育系17-18

3.

1.2 利用反义RNA技术植物雄性不育18

3.

1.3 提早降解胼胝质植物雄性不育系18-19

3.

1.4 细菌基因在植物中组成型表达导致植物雄性不育19

3.

1.5 其他策略19

3.2 Barnase基因与雄性不育19

3.3 基因工程创建雄性不育系的恢复系19-21

3.1 利用雄性不育基因的反义基因19

3.2 利用引起雄性不育基因的抑制基因来恢复育性19-20

3.3 化学调控恢复育性20

3.4 利用定位重组系统来恢复不育植株的育性20-21

3.4 基因工程雄性不育系的保持21

4 植物单性结实研究进展21-24

4.1 人工诱导植物单性结实的策略22-23

4.

1.1 无活力或不亲合的花粉授粉诱导单性结实22

4.

1.2 外源激素处理诱导单性结实22

4.

1.3 射线处理诱导单性结实22-23

4.

1.4 三倍体单性结实果实23

4.2 植物单性结实基因工程研究进展23-24
4.

2.1 iaaM基因在单性结实基因工程中的应用23-24

4.

2.2 iaaM基因在其他基因工程中的应用24

5 火焰卫矛研究进展24-25

5.1 形态特征和生物学特性24

5.2 火焰卫矛资源利用现状24-25

6 本论文研究的目的与25-26
章 火焰卫矛组织培养再生体系的建立26-41
1 与方法26-28

1.1 26

1.2 方法26-28

1.2.1 的预处理26-27

1.2.1 器械准备26

1.2.2 火焰卫矛无菌26-27

1.2.3 不同外植体接种方法27

1.2.2 培养基27

1.2.3 培养条件27

1.2.4 培养27-28

1.2.4.1 火焰卫矛愈伤组织诱导与不定芽分化27

1.2.4.2 壮苗与生根培养27-28

1.2.4.3 炼苗移栽28

2 结果分析28-38
2.1 火焰卫矛无菌诱导培养28-29论文片段—)48-492.8.2质粒DNA提取(小量抽提)492.8.3引物及PCR扩增程序49-503结果分析50-593.1卡那霉素(Kan)选择压的确定50-513.1.1卡那霉素(Kan)对火焰卫矛子叶愈伤组织及不定芽分化的影响50-513.1.2卡那霉素(Kan)对火焰卫矛下胚轴愈伤组织及不定芽分化的影响513.2不同因素对火焰卫矛遗传转化的影响51-553.2.1预培养时间对火火焰卫矛论文,再生论文,组织培养论文,农杆菌论文,遗传转化论文,

2.

1.1 火焰卫矛无菌培养最佳消毒时间确定28-29

2.

1.2 不同培养基对火焰卫矛胚诱导培养的影响29

2.2 火焰卫矛子叶愈伤组织和不定芽分化29-32

2.1 培养基对子叶愈伤组织诱导及芽分化的影响29-30

2.2 不同激素配比对火焰卫矛子叶愈伤组织诱导的影响30-31

2.3 不同激素配比对火焰卫矛子叶不定芽分化的影响31-32

2.3 火焰卫矛下胚轴愈伤组织和不定芽分化32-34

2.3.1 培养基对下胚轴愈伤组织诱导及芽分化的影响32

2.3.2 不同激素配比对火焰卫矛下胚轴愈伤组织诱导的影响32-34

2.3.3 激素配比对下胚轴不定芽分化的影响34

2.4 不同激素浓度对火焰卫矛增殖的影响34-35

2.5 不同苗龄对火焰卫矛子叶愈伤组织诱导和分化的影响35-36

2.6 不同培养基与激素组合对生根诱导的影响36-37

2.7 不同炼苗时间和基质对火焰卫矛移栽的影响37-38

3 讨论38-41

3.1 的消毒与38

3.2 培养对外植体分化的影响38-39

3.3 激素种类和浓度对愈伤组织及不定芽诱导的影响39

3.4 不同培养基和激素对生根的影响39-41

章 农杆菌介导的火焰卫矛遗传转化研究41-61
1 实验42-46

1.1 植物42

1.2 农杆菌菌株及质粒42-43

1.3 主要生物化学试剂43

1.4 主要仪器43

1.5 常用培养基43-44

1.5.1 细菌培养基43-44

1.5.2 植物培养基44

1.6 常用溶液44-46

2 实验方法46-50

2.1 火焰卫矛无菌46

2.2 根癌农杆菌的培养46

2.3 遗传转化46-47

2.4 卡那霉素(Kan)选择压的确定47

2.5 遗传转化技术参数比较47-48

2.5.1 预培养时间47

2.5.2 农杆菌菌液浓度47

2.5.3 农杆菌浸染时间47

2.5.4 共培养时间47

2.5.5 乙酰丁香酮47-48

2.5.6 延迟筛选48

2.6 不同抑菌剂敏感性研究48

2.7 GUS组织化学染色48

2.8 转基因植物的PCR检测48-50

2.8.1 植物基因组DNA的提取(CTAB法)48-49

2.8.2 质粒DNA提取(小量抽提)49

2.8.3 引物及PCR扩增程序49-50

3 结果分析50-59

3.1 卡那霉素(Kan)选择压的确定50-51

3.

1.1 卡那霉素(Kan)对火焰卫矛子叶愈伤组织及不定芽分化的影响50-51

3.

1.2 卡那霉素(Kan)对火焰卫矛下胚轴愈伤组织及不定芽分化的影响51

3.2 不同因素对火焰卫矛遗传转化的影响51-55
3.

2.1 预培养时间对火焰卫矛遗传转化的影响51-52

3.

2.2 共培养时间对火焰卫矛遗传转化的影响52

3.

2.3 菌液浓度对火焰卫矛遗传转化的影响52-53

3.

2.4 浸染时间对火焰卫矛遗传转化的影响53-54

3.

2.5 乙酰丁香酮(AS)对火焰卫矛遗传转化的影响54

3.

2.6 延迟筛选对火焰卫矛遗传转化的影响54-55

3.3 抑菌剂对子叶和下胚轴不定芽分化的影响55-57

3.4 转基因植株的GUS组织染色鉴定57-58

3.5 转基因植株PCR分子检测58-59

4 讨论59-61

4.1 预培养、共培养时间、菌液浓度和OD600值对遗传转化效率的影响59

4.2 卡那霉素(Kan)对转化的影响59-60

4.3 延迟筛选对遗传转化的影响60

4.4 抑菌剂浓度对遗传转化的影响60-61

参考文献61-67
致谢67-68
缩写68-69
附录69-71