试议宿主蝎活性多肽Mucroporin-M1激活MAPK通路抑制HBV复制学术

论文导读：
摘要：乙型肝炎病毒是一种具有嗜肝性的,不引起细胞病变的DNA病毒,大约5-10%的成人感染和90-95%的新生胎儿感染会转为持续的感染。这些持续的感染人群具有极大地危险转化为慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。乙型肝炎病毒侵染导致的疾病已经成为了一种世界范围内的主要健康不足。虽然治疗性的核苷类似物和干扰素被用于乙型肝炎病毒感染者的治疗,但是乙型肝炎感染者人数和乙型肝炎相关的死亡人数逐年递增。由此,进展新的治疗药物或备选资源十分重要。本实验室近期以蝎毒腺cDNA文库中筛选得到了一些阳离子宿主防御肽基因。根据这些基因序列化学合成多肽,并且测试了它们的抗乙型肝炎病毒活性。结果发现细尖狼蝎活性多肽Mucroporin-M1能够有效的抑制乙型肝炎病毒表面抗原和早期抗原的表达。由此,对蝎活性多肽Mucroporin-Ml的抗HBV作用进行了进一步的探讨。首先在乙型肝炎病毒稳转细胞系HepG2.2.15中检测了Mucroporin-M1对乙型肝炎病毒复制的抑制效应。结果显示,Mucroporin-M1能够浓度依赖性的抑制乙型肝炎病毒表面抗原,早期抗原以及病毒子代DNA在细胞上清中的表达和复制。与此同时,在HepG2.2.15细胞内,Mucroporin-M1抑制HBV的DNA, RNA复制中间体以及Core蛋白质的表达,并且这种细胞内的抑制效应也具有浓度依赖性。由于Mucroporin-M1多肽在肝癌细胞系内具有抗乙型肝炎病毒活性,进一步检测了其多肽在乙型肝炎病毒急性感染小鼠体内的活性。实验结果证实了蝎活性多肽Mucroporin-M1能够有效减少小鼠血液内的乙型肝炎病毒表面抗原与早期抗原,同时还能够显著抑制小鼠肝脏细胞内的乙型肝炎病毒复制。Mucroporin-M1多肽在细胞和动物水平上抗HBV效应结果提示,Mucroporin-M1多肽作用于乙型肝炎病毒复制的转录阶段,而不是乙型肝炎病毒的DNA多聚酶反转录阶段,这区别于现有的乙型肝炎病毒治疗性核苷类似物。鉴于此,检测了Mucroporin-M1对乙型肝炎病毒的启动子活性,结果表明Mucroporin-M1多肽能够以浓度依赖的方式有效抑制乙型肝炎病毒启动子的转录活性。另外,采取EMSA实验探讨了Mucroporin-M1是否影响宿主细胞核转录因子与乙型肝炎病毒启动子的结合,以而产生其抑制乙型肝炎病毒启动子转录活性。结果显示,Mucroporin-M1显著降低了肝转录因子4α (HNF4α)与乙型肝炎病毒preCore/Core启动子的结合。Mucroporin-M1多肽降低了HNF4α与乙型肝炎病毒preCore/Core启动子的结合解释了Mucroporin-M1多肽对乙型肝炎病毒转录的抑制作用。进一步通过实时定量PCR和Western Blotting浅析发现,Mucroporin-M1在乙型肝炎病毒复制的HepG2.2.15细胞内浓度依赖抑制HNF4α的表达。由此,Mucroporin-M1多肽通过抑制HNF4α的表达,进而减少HNF4α蛋白与乙型肝炎病毒preCore/Core启动子的结合,以而对乙型肝炎病毒的转录发挥抑制效用。Western Blotting进一步浅析表明,Mucroporin-M1激活了有丝分裂原激活的蛋白激酶通路(MAPKs),下调HNF4α表达,以而抑制乙型肝炎病毒的复制。而且MAPKs通路的特异性抑制剂在乙型肝炎病毒复制的HepG2.2.15细胞中能够阻断蝎活性多肽Mucroporin-M1激活蛋白激酶通路、抑制HNF4α表达和HBV的子代DNA复制。与此同时,在乙型肝炎病毒感染小鼠体内,Mucroporin-M1也能够显著激活MAPKs通路。综上所述,本探讨发现Mucroporin-M1能够通过激活MAPK通路,下调乙型肝炎病毒复制所必需的转录因子HNF4α的表达。由于HNF4α的表达被下调,乙型肝炎病毒的启动子活性也被抑制,以而导致乙型肝炎病毒的RNA转录被抑制。结果,以病毒RNA为复制模板的病毒子代DNA和蛋白质也被抑制。在乙型肝炎病毒感染的小鼠中,鼠肝和血液中的病毒滴度被Mucroporin-M1多肽有效降低。Mucroporin-M1多肽在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒的复制可能与MAPK通路的激活有关。探讨表明Mucroporin-M1在细胞和动物水平上能够有效地抑论文导读：3.2.1实验材料,试剂和仪器44-453.2.1.1细胞系443.2.1.2质粒443.2.1.3抗体443.2.1.4试剂和试剂盒44-453.2.1.5实验仪器453.2.2实验策略45-593.2.2.1大肠杆菌感受态制备453.2.2.2细胞毒性检测45-463.2.2.3细胞上清HBeAg和HBsAg检测46-473.2.2.4细胞上清中的HBVDNA检测47-483.2.2.5Westernblot检测HBVCore蛋白48
制乙型肝炎病毒复制,其抗乙型肝炎病毒的分子机制是通过激活MAPK通路,抑制HNF4α表达,以而抑制HBV的启动子转录活性,最终抑制病毒的复制。关键词：宿主防御肽论文肝细胞转录因子4α论文小鼠模型论文
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摘要9-12
Abstract12-16
第一章 前言16-36
1 HBV的探讨概况16-26

1.1 HBV病毒以及在体内外的感染16-18

1.1 HBV的结构与组成16

1.2 HBV传播方式和宿主范围16-17

1.3 HBV的体内外感染17-18

1.2 HBV复制周期18-24

1.2.1 吸附和进入18-19

1.2.2 松弛环状DNA的入核19

1.2.3 共价闭合环状DNA的形成和维持19-21

1.2.4 病毒RNA复制21-23

1.2.5 病毒子代DNA合成23-24

1.3 乙型肝炎的治疗与探讨24-26

2 MAPK-HNF4α通路与与HBV复制的相互联系26-30

2.1 MAPK-ERK通路27-28

2.2 MAPK-JNK通路28

2.3 MAPK-p38通路28-29

2.4 MAPK-HNF4α通路与HBV复制的联系29-30

3 阳离子宿主防御肽抗病毒探讨概况30-35
4 本工作出发点35-36
第二章 抗HBV多肽Mucroporin-M1的筛选36-43

2.1 引言36

2.2 材料与策略36-39

2.1 实验材料,试剂和仪器36-38

2.2.

1.1 细胞系36-37

2.2.

1.2 细胞培养基以及相关溶液配制37

2.2.

1.3 蝎毒素多肽的合成37

2.2.

1.4 Epsa试剂盒37-38

2.2.

1.5 实验仪器38

2.2.2 实验策略38-39

2.1 细胞培养38

2.2 多肽抑制HBV活性筛选38-39

2.3 多肽序列浅析39

2.3 实验结果39-42

2.3.1 Mucroporin-M1以及其他多肽的分离鉴定39-41

2.3.2 抗HBV多肽Mucroporin-M1的鉴定41-42

2.4 讨论42-43

第三章 Mucroporin-M1多肽体外抑制HBV的复制43-67

3.1 引言43-44

3.2 材料与策略44-59

3.

2.1 实验材料,试剂和仪器44-45

3.2.

1.1 细胞系44

3.2.

1.2 质粒44

3.2.

1.3 抗体44

3.2.

1.4 试剂和试剂盒44-45

3.2.

1.5 实验仪器45

3.2.2 实验策略45-59
3.

2.1 大肠杆菌感受态制备45

3.

2.2 细胞毒性检测45-46

3.

2.3 细胞上清HBeAg和HBsAg检测46-47

3.

2.4 细胞上清中的HBV DNA检测47-48

3.

2.5 Western blot检测HBV Core蛋白48-50

3.

2.6 Northern blot 检测 HBV RNA50-56

3.

2.7 Southern blot 检测 HBV DNA56-59

3.3 实验结果59-65

3.1 Mucroporin-M1对细胞生长的影响59-60

3.2 Mucroporin-M1对细胞上清中病毒的抑制效应60-62

3.3.2.1 Mucroporin-M1对细胞上清中HBeAg和HBsAg的抑制效应60-61
3.3.

2.2 Mucroporin-M1对细胞上清中HBV DNA的抑制效应61-62

3.3.3 Mucroporin-M1对细胞内HBV病毒的抑制62-65

3.1 Mucroporin-M1抑制细胞内HBV Core蛋白的表达62-63

3.3.3.2 Mucroporin-M1对细胞内HBV DNA的浓度依赖抑制效应63-64

3.3 Mucroporin-M1抑制细胞内HBV RNA的表达64-65

3.4 讨论65-67

第四章 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠体内HBV的复制67-74

4.1 引言67

4.2 材料与策略67-69

4.

2.1 实验材料,试剂和仪器67-68

4.2.

1.1 实验动物67

4.2.

1.2 实验试剂和材料67-68

4.2.2 实验策略68-6论文导读：期间发表论文以及获得专利113-114致谢114上一页123
9
4.

2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型构建及多肽处理68

4.

2.2 小鼠血液中HBeAg和HBsAg抗原检测68-69

4.

2.3 组织切片和免疫组化69

4.3 实验结果69-72
4.3.1 Mucroporin-M1多肽对小鼠血清中HBeAg和HBsAg的抑制69-71
4.

3.2 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠肝细胞中HBcAg的表达71-72

4.4 讨论72-74
第五章 Mucroporin-M1体外抑制HBV复制的作用机制74-97

5.1 引言74

5.2 材料与策略74-85

5.

2.1 实验材料,试剂和仪器74-77

5.2.

1.1 质粒74-76

5.2.

1.2 试剂76

5.2.

1.3 试剂盒76

5.2.

1.4 实验仪器76-77

5.2.2 实验策略77-85
5.

2.1 细胞总RNA的提取77

5.

2.2 cDNA一链的反转录合成77

5.

2.3 实时定量PCR77-79

5.

2.4 超纯质粒的提取79

5.

2.5 双荧光素酶实验79-81

5.

2.6 凝胶阻滞实验81-84

5.

2.7 Western blot检测HNF4α84-85

5.

2.8 细胞MAPK通路的检测85

5.

2.9 MAPK抑制剂对HBV DNA影响的检测85

5.3 实验结果85-94
5.

3.1 Mucroprin-M1多肽抑制HBV病毒启动子转录活性85-87

5.3.2 Mucroprin-M1对反式转录因子结合HBV启动子顺式元件的影响87-89
5.

3.3 Mucroprin-M1抑制HNF4α的表达89-90

5.

3.4 Mucroprin-M1对MAPK通路的激活作用90-92

5.3.5 MAPK通路抑制剂对Mucropr in-M1激活MAPK通路作用的阻断92-94

5.4 讨论94-97

第六章 Mucroporin-M1抑制小鼠体内HBV复制的作用机制97-102

6.1 引言97

6.2 材料与策略97-99

6.

2.1 实验材料,试剂和仪器97-98

6.2.

1.1 实验动物97-98

6.2.

1.2 实验试剂和材料98

6.2.2 实验策略98-99
6.

2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型构建及多肽处理98

6.

2.2 小鼠肝脏细胞蛋白提取和制样98-99

6.

2.3 Western blot检测MAPK蛋白和HBV Core蛋白99

6.3 实验结果99-100

6.4 讨论100-102

实验总结与展望102-104
参考文献104-113
博士期间发表论文以及获得专利113-114
致谢114