浅析何首乌何首乌悬浮细胞系建立和稳定同位素示踪二苯乙烯苷合成路径

论文导读：
摘要：二苯乙烯苷（2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)是何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、安神、预防和治疗阿尔茨海默症作用。目前二苯乙烯苷探讨集中在提取和药理方面，对二苯乙烯苷的生物合成路径未见报道，由此二苯乙烯苷的合成路经值得探讨。首先获得何首乌愈伤组织，然后建立何首乌悬浮细胞系。利用普通前体饲喂和稳定同位素前体示踪何首乌悬浮细胞，通过HPLC-MS/MS进行检测，根据检测结果推测二苯乙烯苷生物合成路径。本论文主要探讨结果如下：（1）通过正交实验获得何首乌愈伤组织的诱导培养基：含有1mg·L~(-1)2,4-D和0.4mg·L~(-1)NAA的MS培养基。在此培养基中，15天就能诱导出愈伤组织，愈伤组织的诱导率为96.7%。检测了何首乌根、茎、叶的愈伤组织诱导效果和二苯乙烯苷的含量，发现何首乌根、茎和叶都能诱导出愈伤组织，其中根诱导出的愈伤组织中二苯乙烯苷含量最高，为1.5mg·g~(-1)，由此选择二苯乙烯苷含量高的根愈伤组织进行培养。何首乌愈伤组织比较致密，不能进行悬浮细胞培养。通过把何首乌愈伤组织接入液体MS培养基中培养4天，然后转接到含有不同植物生长激素的固体MS培养基中进行培养，获得了疏松易碎的愈伤组织，通过实验获得适合何首乌疏松愈伤组织生长的植物生长激素配比：0.2mg·L~(-1)6-BA和0.5mg·L~(-1)NAA。（2）比较了何首乌在MS、B5和N6培养基生长的效果，发现MS培养基是何首乌液体最佳生长培养基，在此培养基中生长的细胞干重和二苯乙烯苷含量分别为6.35g·L~(-1)和42.23mg·L~(-1)，由此选择MS培养基作为何首乌悬浮培养基。（3）通过把悬浮细胞铺在平板上，培养30天后，挑选生长快的小细胞团转接到新的平板继续培养，然后每隔15天转接一次，共转接6次，检测不同细胞团的二苯乙烯苷含量，最终获得高含量二苯乙烯苷的细胞系，此高含量何首乌悬浮细胞的干重和二苯乙烯苷的含量分别达到7.46g·L~(-1)DW和56.23mg·L~(-1)，而原细胞系悬浮细胞的干重和二苯乙烯苷含量分别6.55g·L~(-1)DW和4

3.39mg·L~(-1)，此高含量细胞系悬浮培养干重比原细胞系提论文导读：

升了13.89%，二苯乙烯苷含量比原细胞系提升了29.59%。通过发酵条件优化，获得何首乌悬浮细胞系最佳的培养条件为100rpm、26℃暗培养16天。（4）为了筛选二苯乙烯苷合成路径的前体和饲喂探讨，在何首乌悬浮细胞培养的第10天，在何首乌悬浮细胞MS培养基中分别加入不同浓度的苯丙氨酸，发现添加60mg·L~(-1)的苯丙氨酸时何首乌悬浮细胞中二苯乙烯苷含量最高，达到105.15mg·L~(-1)，比没有加苯丙氨酸的对照组（55.23mg·L~(-1)）增加了90.38%，这说明苯丙氨酸能增加二苯乙烯苷含量，可能是二苯乙烯苷的前体。在何首乌悬浮细胞培养基中分别加入不同浓度的肉桂酸，发现添加40mg·L~(-1)的肉桂酸时何首乌悬浮细胞达到最大二苯乙烯苷含量：123.03mg·L~(-1)，比没有加肉桂酸的对照组（55.23mg·L~(-1)）增加了122.76%，这说明肉桂酸能增加二苯乙烯苷含量，可能是二苯乙烯苷的前体。在何首乌悬浮细胞培养基中分别加入不同浓度的乙酸钠，发现添加20mg·L~(-1)的乙酸钠，何首乌悬浮细胞能达到最大二苯乙烯苷含量：89.08mg·L~(-1)，比没有加乙酸钠的对照组（55.23mg·L~(-1)）增加了61.29%，这说明乙酸钠能增加二苯乙烯苷含量，可能是二苯乙烯苷的前体。在液体MS培养基中分别加入不同浓度苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠的混合前体，发现添加40mg·L~(-1)的肉桂酸和20mg·L~(-1)乙酸钠，何首乌悬浮细胞二苯乙烯苷含量最大：162.65mg·L~(-1)，比对照组（55.23mg·L~(-1)）增加了194.50%，说明混合前体效果最好。（5）在何首乌液体MS培养基中加入U~(-1)3C9苯丙氨酸示踪，通过HPLC-MS/MS检测，~(13)C标记的苯丙氨酸能结合进入二苯乙烯苷，这确证了苯丙氨酸是二苯乙烯苷的前体。在何首乌液体MS培养基中加入U~(-1)3C9肉桂酸示踪，通过HPLC-MS/MS检测，~(13)C标记的肉桂酸能结合进入二苯乙烯苷，这确证了肉桂酸也是二苯乙烯苷的前体，并且示踪实验证明了我们假定的二苯乙烯苷合成路径。根据以上结论，我们证明了何首乌二苯乙烯苷的生物合成路径：苯丙氨酸作为前体，在苯丙氨酸解氨作用下合成肉桂酸，再经过几步反应合成二苯乙烯苷。关键词：何首乌论文论文导读：
二苯乙烯苷论文愈伤组织论文悬浮培养论文稳定同位素示踪论文~(13)C标记论文生物合成路径论文
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ABSTRACT7-9
目录9-12
第一章 绪论12-38

1.1 何首乌介绍12-13

1.2 何首乌二苯乙烯苷的理化性质13-15

1.2.1 二苯乙烯苷的理化性质13-14

1.2.2 二苯乙烯苷的提取分离14

1.2.3 二苯乙烯苷的测定14-15

1.3 二苯乙烯苷的药理作用15-20

1.3.1 抗衰老作用和调节血脂作用15-17

1.3.2 抗肿瘤作用17

1.3.3 增强记忆力和安神的作用17-19

1.3.4 THSG 的抗炎作用和保肝作用19-20

1.4 植物次生代谢路径20-26

1.4.1 萜类化合物的生物合成路径20-23

1.4.2 生物碱生物合成路径23

1.4.3 苯丙烷类化合物的生物合成路径23-26

1.5 植物次级代谢产物合成路径探讨策略26-35

1.5.1 天然前体化合物饲喂27-28

1.5.2 放射性标记的前体示踪28-30

1.5.3 稳定同位素标记的前体示踪30-31

1.5.4 后生物合成核磁共振技术31-34

1.5.5 植物次生代谢路径的基因工程技术34-35

1.6 本课题的探讨目的、作用和主要内容35-38

1.6.1 探讨目的作用35-37

1.6.2 探讨主要内容37-38

第二章 何首乌悬浮细胞系的建立和培养条件探讨38-70

2.1 引言38-40

2.2 材料与策略40-43

2.1 实验材料和试剂40

2.2 主要仪器40

2.3 愈伤组织的诱导和继代40-41

2.4 何首乌悬浮培养系统的建立41

2.5 HPLC 测定愈伤组织、悬浮细胞二苯乙烯苷含量41-42

2.6 悬浮细胞生长速度和二苯乙烯苷测定策略42-43

2.7 单细胞平板培养的制作与培养条件43

2.8 摇床转速、培养温度和接种量对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响43

2.9 诱导子对何首乌悬浮细胞二苯乙烯苷含量的影响43

2.3 结果与讨论43-68

2.3.1 何首乌愈伤组织诱导培养基的筛选43-47

2.3.2 何首乌根、茎、叶愈伤组织中二苯乙烯苷含量47-49

2.3.论文导读：

3 何首乌疏松愈伤组织的诱导49-55

2.3.4 何首乌悬浮培养系统的建立55

2.3.5 不同培养基对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响55-56

2.3.6 何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量曲线56-57

2.3.7 高含量二苯乙烯苷细胞系的筛选57-58

2.3.8 摇床转速、培养温度和接种量对何首乌悬浮细胞二苯乙烯苷含量的影响58-61

2.3.9 SA 诱导子对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响61-62

2.3.10 SA 不同添加时间对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响62-63

2.3.11 MeJA 诱导子对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响63-68

2.4 本章小结68-70

第三章 二苯乙烯苷合成路径的前体筛选和饲喂探讨70-81

3.1 引言70-71

3.2 材料与策略71-73

3.

2.1 实验材料和试剂71-72

3.

2.2 主要仪器72

3.

2.3 策略72

3.

2.4 悬浮细胞和二苯乙烯苷测定策略72-73

3.3 结果与讨论73-79

3.1 饲喂时间对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响73-74

3.2 不同浓度苯丙氨酸对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响74-75

3.3 不同浓度肉桂酸对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响75

3.4 不同浓度乙酸钠对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响75-76

3.5 不同浓度酪氨酸对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响76-77

3.6 结合前体对何首乌悬浮细胞生长和二苯乙烯苷含量的影响77-79

3.4 本章小结79-81

第四章 13C 标记前体示踪阐明二苯乙烯苷合成路径81-92

4.1 引言81-82

4.2 材料与策略82-84

4.

2.1 实验材料和试剂82

4.

2.2 主要仪器82-83

4.

2.3 策略83

4.

2.4 悬浮细胞和二苯乙烯苷测定策略83-84

4.3 结果与讨论84-91
4.

3.1 (U-13C9)苯丙氨酸示踪何首乌悬浮细胞84-86

4.

3.2 (U-13C9)肉桂酸示踪何首乌悬浮细胞86-91

4.4 本章小结91-92
结论和展望92-94
参考文献94-111
附录 缩写词（Abbreviation）111-112
攻读博士学位期间取得的探讨成果112-113
致谢113-114
附件114