研讨蛋白江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶在麦胚无细胞蛋白合成系统中表达和优化要求

论文导读：结果35-362.4.3重组质粒pGEM-Teasy/VK的酶切鉴定362.4.4蛇毒激肽释放酶全长基因测序结果浅析36-382.4.5重组表达质粒pCS~(2+)/VK的鉴定38-392.4.6重组表达质粒pCS~(2+)/VK测序结果392.5讨论39-402.6小结40-41第三章蛇毒激肽释放酶的体外转录和翻译41-51

3.1概述4112下一页

摘要：本探讨在成功克隆得到江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶目的基因的基础上，在蛇毒激肽释放酶基因序列上引入BamHI和XhoI两个酶切位点以及由六个组氨酸组成的组氨酸标签，并将其与pCS~(2+)表达载体相连，构建了质粒pCS~(2+)/VK，经过酶切测序验证插入方向正确且未引起碱基序列的变化。将pCS~(2+)/VK线性化后，进行体外转录，得到适合进行翻译的模板mRNA。再将mRNA同自制麦胚抽提物以及翻译缓冲液混合，26°C孵育16h，将反应后的混合物进行SDS-PAGE电泳，能够得到一条大约43kDa的条带，经Western blot验证为所需要目的蛋白。麦胚无细胞蛋白表达系统在安全准确的合成功能蛋白方面具有很大的潜力，但是能源物质的供应以及模板mRNA的稳定性一直是影响系统产率的主要因素。本论文中磷酸肌酸和丙酮酸作为提供ATP二次能源物质加入系统中，在对蛋白产率进行比较之后，发现磷酸肌酸更适合于麦胚无细胞蛋白合成系统；为了提升mRNA模板稳定性，向系统中补充了质粒载体、SP6RNA聚合酶以及铜离子，并对这些条件进行了优化，最终建立了一个高效快速的麦胚无细胞蛋白合成系统。当向系统中加入30ng/μL质粒载体、15U SP6RNA聚合酶、25mM磷酸肌酸以及5mM Cu~(2+)后，并在26°C反应16h时，蛇毒激肽释放酶产量以0.13mg/mL提升到0.74mg/mL。通过固定化金属亲和层析法(IMAC)对重组蛇毒激肽释放酶进行分离纯化，将纯化后的蛋白透析冻干，将重组蛋白(1.3U/mg)与天然蛇毒激肽释放酶(1.736U/mg)以及去糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶(1.528U/mg)的活性进行了比较，发现重组蛇毒激肽释放酶比活力与天然蛇毒激肽释放酶比活力差别不显著，而与去糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶更接近。本探讨成果为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶结构功能探讨以及麦胚无细胞蛋白合成系统的工业化运用奠定了良好的基础。关键词：无细胞蛋白合成论文麦胚论文蛇毒激肽释放酶论文重组蛋白论文
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ABSTRACT4-9
缩略词9-10
第一章 文献综述10-26

1.1 无细胞蛋白表达系统概述10-14

1.1 大肠杆菌无细胞蛋白表达系统11-12

1.2 兔网织红细胞系统12

1.3 麦胚无细胞蛋白合成系统12-14

1.2 无细胞表达系统探讨进展14-18

1.2.1 利用麦胚无细胞蛋白合成系统合成的蛋白14

1.2.2 麦胚无细胞蛋白合成机制14-15

1.2.3 无细胞表达系统的优点15

1.2.4 无细胞表达系统中有着的不足15-17

1.2.5 无细胞蛋白表达系统的运用和进展前景17-18

1.3 江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶综述18-24

1.3.1 激肽释放酶作用机制18-21

1.3.2 激肽释放酶的运用21-22

1.3.3 蛇毒中的激肽释放酶22-24

1.4 探讨目的及作用24-25

1.5 探讨内容及技术路线25-26

第二章 江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶表达载体的构建26-41

2.1 概述26

2.2 材料与试剂26-28

2.1 菌株、质粒、酶及试剂26

2.2 常用试剂配制26-28

2.3 主要仪器设备28

2.3 实验策略28-34

2.3.1 江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶全长基因的 PCR 扩增28-30

2.3.2 构建克隆质粒 pGEM-T easy/VK30-32

2.3.3 DNA 序列测定与浅析32

2.3.4 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 的构建32-34

2.4 结果与浅析34-39

2.4.1 PCR 扩增蛇毒激肽释放酶基因34-35

2.4.2 全长基因胶回收结果35-36

2.4.3 重组质粒 pGEM-T easy/VK 的酶切鉴定36

2.4.4 蛇毒激肽释放酶全长基因测序结果浅析36-38

2.4.5 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 的鉴定38-39

2.4.6 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 测序结果39

2.5 讨论39-40

2.6 小结40-41

第三章 蛇毒激肽释放酶的体外转录和翻译41-51

3.1 概述41

3.论文导读：24.2.1实验材料514.2.2常用试剂配制51-524.3主要仪器524.4实验策略52-534.4.1两种二次能源物质磷酸肌酸和丙酮酸的比较524.4.2磷酸肌酸浓度的优化524.4.3Cu~(2+)浓度优化52-534.4.4转录翻译偶联系统的构建以及质粒浓度的优化534.4.5转录翻译偶联系统反应温度的优化534.5结果与浅析53-564.

5.1二次能源物质磷酸肌酸

2 材料与试剂41-44
3.

2.1 实验材料41-42

3.

2.2 常用试剂配制42-44

3.

2.1 抽提物缓冲液42

3.

2.2 体外翻译所需溶液42

3.

2.3 蛋白质电泳溶液42-43

3.

2.4 Western blot 溶液43

3.

2.5 RNA 电泳检测：43-44

3.3 主要仪器44

3.4 实验策略44-47

3.4.1 蛇毒激肽释放酶的体外转录44-45

3.4.2 麦胚抽提物的制备[92]45-46

3.4.3 蛇毒激肽释放酶的体外翻译46

3.4.4 目的蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测46-47

3.4.5 目的蛋白的 Western blot 检测47

3.5 结果与浅析47-49

3.5.1 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 线性化47-48

3.5.2 蛇毒激肽释放酶的体外转录结果48-49

3.5.3 蛇毒激肽释放酶的体外翻译结果49

3.6 讨论与小结49-51

第四章 麦胚无细胞蛋白合成系统的优化51-57

4.1 概述51

4.2 材料与试剂51-52

4.

2.1 实验材料51

4.

2.2 常用试剂配制51-52

4.3 主要仪器52

4.4 实验策略52-53

4.1 两种二次能源物质磷酸肌酸和丙酮酸的比较52

4.2 磷酸肌酸浓度的优化52

4.3 Cu~(2+)浓度优化52-53

4.4 转录翻译偶联系统的构建以及质粒浓度的优化53

4.5 转录翻译偶联系统反应温度的优化53

4.5 结果与浅析53-56

4.5.1 二次能源物质磷酸肌酸和丙酮酸对蛋白产率的影响53-54

4.5.2 二次能源物质磷酸肌酸浓度对蛋白产率的影响54

4.5.3 Cu~(2+)浓度对蛋白产率的影响54-55

4.5.4 质粒浓度的优化55

4.5.5 反应温度的优化55-56

4.6 讨论56-57

第五章 重组蛇毒激肽释放酶的纯化和酶学性质探讨57-63

5.1 概述57

5.2 材料与试剂57-58

5.

2.1 实验材料57

5.

2.2 试剂配制57-58

5.3 主要仪器58

5.4 试验策略58-60

5.

4.1 重组蛇毒激肽释放酶的分离纯化58

5.

4.2 重组蛇毒激肽释放酶酶活测定58-59

5.

4.3 蛋白浓度测定策略59-60

5.5 结果与浅析60-62

5.1 重组蛇毒激肽释放酶分离纯化结果60-61

5.2 重组蛇毒激肽释放酶酶学性质61-62

5.6 讨论62-63

第六章 全文总结与展望63-65

6.1 结论63

6.2 展望63-65

参考文献65-72
发表论文和参加科研情况说明72-73
致谢73