浅议还原克鲁维酵母不对称还原合成倍他司汀重要手性中间体

论文导读：
摘要：手性芳基醇是合成光学活性分子的关键中间体，广泛运用于食品、医药、精细化工及农业等领域。在手性化合物的制备历程中，与化学合成法相比，利用生物法进行的合成反应具有立体选择性强，反应条件温和，对环境的污染轻等优点。近年来利用微生物细胞内羰基还原酶不对称还原制备手性醇类化合物的策略得到人们越来越多的青睐。(S)-(4-)-(吡啶-2-基)-甲醇[(S)-CPMA]是用于合成抗组胺药物倍他司汀的重要手性中间体。本论文通过对实验室保藏及土壤中菌种进行筛选，获得了一株将前手性酮底物(4-)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)不对称还原为(S)-CPMA的还原酶产生菌株，并根据18S rRNA基因序列比对结果将其鉴定为Kluyveromyces sp.。通过优化水相系统中所筛菌株催化不对称还原CPMK生成(S)-CPMA的反应条件，确定了菌体浓度为100g/L，底物浓度为2g/L，30℃条件下，在pH7.0并含有5%葡萄糖的磷酸钾缓冲溶液中反应48h，其e.e.值和产率分别可以达到76.0%和77.0%。采取筛选获得的Kluyveromyces sp.进行生物转化反应，在水相反应系统优化的基础上对双水相反应系统进行了探讨，确定PEG4000(20%, w/w)/Na_2HPO_4(14%, w/w)为适宜的双水相反应系统组成。采取该反应系统，在底物浓度为6g/L，30℃下反应48h，产物(S)-CPMA的e.e.值和产率与水相反应系统相比有显著提升，分别达到86.7％和92.1%。同时，反应的底物和产物在双水相系统的上层PEG溶液中富集，两相分配系数K=6.57，使Kluyveromyces sp.整体细胞的底物耐受性和生物相容性有所改善。本探讨首次筛选获得了不对称还原制备(S)-CPMA的微生物菌株并在双水相反应系统中运用，为生物催化制备该手性药物中间体提供了可行的途径。为进一步探讨催化该反应的关键羰基还原酶，对Kluyveromyces sp.细胞进行超声波破碎获得粗酶液，经过硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析，目的蛋白的比活由0.072U/mg提升至23.5U/mg，纯化倍数达到326倍，酶活回收率为14.3%，SDS-PAGE确定羰基还原酶亚单位的分子量约为30kDa。对纯化得到的羰基还原酶进行一系列酶学性质探讨：确定了羰基还原酶为NADH辅酶依赖型；对带有苯环的芳基酮类化合物具有较高的催化活性，酶的最适反应pH为pH6.5，在pH5–7.5的缓冲液中保存24h相对剩余酶活在80%以上；其最适反应温度为30℃，在20–35℃范围内相对酶活能够保持在80%以上，其最适反应温度为30℃，在高于40℃时易失活。添加Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ni~(2+)对酶活有一定的推动作用，而Ba~(2+)、Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)的有着会对酶活性产生强烈的抑制。关键词：(S)-(4-)-(吡啶-2-基)-甲醇论文不对称还原论文Kluyveromyces论文sp.论文双水相系统论文倍他司汀论文羰基还原酶论文纯化论文
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Abstract4-5
目录5-8
第一章 绪论8-16

1.1 手性化技术及其运用8-9

1.2 手性醇化合物及其生物法合成9-10

1.2.1 生物法动力学拆分9-10

1.2.2 生物法不对称还原10

1.3 不对称还原前手性芳基酮微生物的获得10-11

1.3.1 依靠已知序列和基因数据库采取基因挖掘对策构建重组菌株10-11

1.3.2 以自然界中筛选不对称还原芳基族羰基化合物为手性芳基醇的菌株11

1.4 双水相系统中的生物反应11

1.5 立体选择性羰基还原酶的分离纯化11-12

1.6 不对称合成(S)-CPMA 的探讨进展12-13

1.6.1 产品概况12

1.6.2 生物技术在制药行业的进展近况12

1.6.3 组胺及抗组胺药物的市场概况12-13

1.6.4 (S)-(4-)(吡啶-2-基)甲醇合成技术概况1论文导读：凝胶层析39-403.10.5蛋白质纯化结果40-413.10.6Kluyveromycessp.的羰基还原酶酶学性质的探讨41-47主要结论与展望47-49主要结论47-48展望48-49致谢49-50参考文献50-55附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文55上一页12
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1.7 论文的探讨作用和主要探讨内容13-16

1.7.1 课题来源13

1.7.2 课题的探讨作用13-14

1.7.3 课题的主要内容14-16

第二章 材料与策略16-22

2.1 材料16-17

2.

1.1 菌种16

2.

1.2 试剂16

2.

1.3 主要仪器设备16

2.

1.4 主要培养基16-17

2.2 策略17-22

2.1 菌种筛选17

2.2 菌株细胞发酵还原酶活力的测定17

2.3 菌株细胞在水相系统中的不对称还原反应17-18

2.4 菌株细胞透性化处理策略18

2.5 添加剂对 CPMK 不对称还原反应的影响18

2.6 双水相反应系统的筛选18

2.7 PEG 4000/Na_2HPO_4双水相系统相图绘制策略18-19

2.8 双水相系统中的不对称还原反应19

2.9 HPLC 检测浅析策略19

2.10 产品的分离与鉴定19

2.11 Kluyveromyces sp.胞内羰基还原酶的分离纯化19-21

2.2.12 Kluyveromyces sp.胞内羰基还原酶的最适反应温度和热稳定性21
2.2.13 Kluyveromyces sp.胞内羰基还原酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性21

2.14 Kluyveromyces sp.胞内羰基还原酶的底物特异性21

2.15 反应产物 e.e.值和产率的计算21-22

第三章 结果与讨论22-47

3.1 菌种筛选22-23

3.2 绘制系统进化树23-24

3.3 Kluyveromyces sp.发酵产酶时间进程曲线24

3.4 Kluyveromyces sp.水相转化反应条件优化24-29

3.4.1 反应 pH 对 CPMK 不对称还原反应的影响24-25

3.4.2 反应温度对 CPMK 不对称还原反应的影响25-26

3.4.3 菌体浓度对 CPMK 不对称还原反应的影响26-27

3.4.4 辅底物对 CPMK 不对称还原反应的影响27

3.4.5 底物浓度对 CPMK 不对称还原反应的影响27-28

3.4.6 产物浓度对 CPMK 不对称还原反应的影响28-29

3.4.7 水相反应时间对 CPMK 不对称还原反应的影响29

3.5 细胞透性处理对不对称还原 CPMK 的影响29-30

3.6 不同添加剂对 CPMK 不对称还原反应的影响30-31

3.7 双水相反应系统的筛选31

3.8 双水相反应系统条件优化31-35

3.8.1 绘制 PEG 4000/Na_2HPO_4的双水相相图31-32

3.8.2 PEG 4000 含量对还原 CPMK 反应的影响32-33

3.8.3 Na2HPO4含量对还原 CPMK 反应的影响33

3.8.4 双水相系统中底物浓度对不对称还原 CPMK 反应的影响33-34

3.8.5 双水相系统中不对称还原 CPMK 的反应时间进程曲线34-35

3.8.6 双水相系统中不对称还原 CPMK 的 1 L 系统反应时间进程曲线35

3.9 产品的分离与鉴定35-36

3.10 Kluyveromyces sp.胞内羰基还原酶的分离纯化36-47

3.10.1 超声破碎条件的确定36-38

3.10.2 硫酸铵分级沉淀38-39

3.10.3 DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析39

3.10.4 Sephadex G-100 凝胶层析39-40

3.10.5 蛋白质纯化结果40-41

3.10.6 Kluyveromyces sp.的羰基还原酶酶学性质的探讨41-47
主要结论与展望47-49
主要结论47-48
展望48-49
致谢49-50
参考文献50-55
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文55