谈化学探针分子构筑及化学生物学运用

论文导读：,我们在其原有结构中加入了可以发生生物正交反应的官能团,得到了新的可以作为化学小分子探针的活性分子1a-1c。将1a-1c作用于其它几种miRNA后,发现1a-1c对这些miRNA均有抑制作用,表明1a-1c是一类广谱型的niRNA抑制剂。但1a-1c作用后细胞中的miRNA表达量并没有转变,而是细胞中的与AG02蛋白结合的miRNA量降低,表明化合物la-1c通
摘要：化学探针是化学生物学探讨中的重要工具,可以帮助我们在分子水平探讨复杂生命体中的生命历程和调控网络,由此化学探针的构建是化学生物学探讨中的重要探讨方向。本论文工作主要就化学小分子探针的构建及以化学小分子探针为工具,针对生物医学探讨中的重要靶标分子包括微小核糖核酸(miRNA)及与肿瘤相关的蛋白酶等,开展了活性调控及机制探讨和荧光分子影像方面的探讨工作,论文主要工作分为以下三个部分：1.通过构建基于荧光素酶报告基因的细胞筛选系统,我们发现了芒果苷元及其衍生物对不同组织特异性的miRNA均有着不同程度的抑制。由此通过对芒果苷元的修饰,我们在其原有结构中加入了可以发生生物正交反应的官能团,得到了新的可以作为化学小分子探针的活性分子1a-1c。将1a-1c作用于其它几种miRNA后,发现1a-1c对这些miRNA均有抑制作用,表明1a-1c是一类广谱型的niRNA抑制剂。但1a-1c作用后细胞中的miRNA表达量并没有转变,而是细胞中的与AG02蛋白结合的miRNA量降低,表明化合物la-1c通过阻断miRNA与AG02蛋白结合发挥抑制作用。接下来,我们以la为分子探针对其作用靶标进行探讨性探讨,初步结果支持AG02蛋白可能与这类芒果苷元衍生物结合这一结论。化合物1a-lc还可以特异性地引起癌细胞的凋亡,但对正常细胞影响不大,在小鼠活体水平的实验中化合物1a也显示出对肿瘤生长的显著抑制。通过这些结果,我们初步证实了将1a-1c作为化学小分子探针对其对miRNA的6作用机制进行探讨的可行性,并且也提供了一类在治疗癌症方面有潜在运用的小分子候选物。2.我们构建了一种针对结肠癌等上皮细胞癌中高表达蛋白酶FAPα的近红外荧光探针ANPFAP。ANPFAP分子中通过FAPα的特异性底物(KGPGPNQC)将近红外染料(Cy5.5)和荧光淬灭染料(QSY21)相连,使得其中Cy5.5的荧光被QSY21有效淬灭,仅在在遇到]FAPα蛋白酶时连接Cy5.5与QSY21的底物肽段被断开,Cy5.5的荧光被激活。体外酶切实验证实了ANPFAP对FAPα有着较好的敏感性和特异性。细胞实验也证实了ANPFAP在有FAPα表达的U87MG细胞中荧光被激活,而在没有FAPα表达的C6细胞中探针分子保持荧光淬灭状态。小鼠活体肿瘤模型上实验的结果也同样表明了在高表达FAPα的U87MG肿瘤组织中,ANPFAp被有效激活而产生强的近红外荧光信号,而在作为对照的C6肿瘤中ANPFAp则仅产生微弱的背景荧光信号,表明ANPFAp在体内也有着很高的选择性,离体实验证实了ANPFAp可有效富集在肿瘤部位。这些结果说明ANPFAp有可能作为一种早期诊断有FAPα表达的肿瘤的荧光探针。3.我们初步尝试了利用点击反应和光点击反应这两种生物正交反应作为化学连接策略构建针对结直肠癌的多模态分子影像探针。探针的构建对策是利用铁磁性纳米颗粒(Fe304)作为载体和磁共振显影剂,将对结直肠癌内高表达的蛋白酶FAPα可产生荧光激活响应的荧光探针分子与具有肿瘤靶向性的环状RGD同时连接在磁性纳米颗粒的表面。我们首先在小分子水平上对这两种反应的动力学进行了比较,较为理想的点击反应的底物浓度为mM,而发生快速的光点击反应的底物浓度可低至μM,由此在构建多模态分子影像探针时我们采取光点击反应连接荧光探针和纳米粒子,而采取点击反应连接肿瘤靶向基团与纳米探针。实验结果证实了我们所设计的连接对策的可行性,但同时显示Cy5.5修饰的FAPα作用底物肽段在连接到Fe304纳米粒子表面后没有通过荧光共振能量转移效应实现对Cy5.5荧光的淬灭。我们进而结合第三章中所用的激活型探针,通过在分子上修饰丙烯酰基团进而通过光点击反应将其连接到Fe3O4纳米粒子表面,实验结果显示连接策略可行且该纳米粒子在FAPα作用前后产生显著的近红外荧光激活现象。此外,我们也尝试了利用光点击反应进行F标记以用于核素成像的小分子探针的构建。这些初步的实验结果证实了将光点击反应和点击反应联合运用到构建多模态探针中的可行性,但仍有一些不足需要解决。关键词：
【学位授予单位】：论文南京大学
【学位级别】：论文博士
【学位授予年份】：论文2012
【分类号】：论文O621.25
【目录】：论文中文摘要6-8
Abstract8-11
第一章 前言11-28

1.1 小分子探针与化学生物学探讨11-12

1.2 生物正交反应与小分子探针12-15

1.3 微小核糖核酸(microRNA)与小分子调控15-20

1.4 肿瘤相关蛋白酶与荧光成像20-23

1.5 立题依据23-24

参考文献24-28
第二章 microRNA的广谱抑制剂论文导读：活性34-352.4化合物1a对miRNA的抑制作用机制探讨35-372.5化合物1b及1c对miRNA的抑制活性及机理探讨37-392.6化合物1a-1c抑制miRNA功能的直接作用靶点探讨39-432.7化合物1a-1c对癌细胞凋亡的推动43-482.8化合物1a对小鼠肿瘤的生长抑制48-51小结51-52实验部分52-55参考文献55-58第三章FAPα响应型近红外分子影像探针58-7
型小分子探针28-58
引言28-31
结果与讨论31-51

2.1 对microRNA有抑制活性的小分子化合物的筛选31-33

2.2 芒果苷元单取代产物1a-1c33-34

2.3 芒果苷元衍生物1a对miRNA的抑制活性34-35

2.4 化合物1a对miRNA的抑制作用机制探讨35-37

2.5 化合物1b及1c对miRNA的抑制活性及机理探讨37-39

2.6 化合物1a-1c抑制miRNA功能的直接作用靶点探讨39-43

2.7 化合物1a-1c对癌细胞凋亡的推动43-48

2.8 化合物1a对小鼠肿瘤的生长抑制48-51

小结51-52
实验部分52-55
参考文献55-58
第三章 FAPα响应型近红外分子影像探针58-77
引言58-59
结果与讨论59-70

3.1 FAPα特异性探针的设计及合成59-61

3.2 ANP_(FAP)对FAPα的敏感性及特异性测试61-63

3.3 探针分子ANP_(FAP)的体内荧光成像效果评估63-66

3.4 探针分子ANP_(FAP)的组织分布情况检测66-68

3.5 讨论68-70

小结70-71
实验部分71-73
参考文献73-77
第四章 针对结直肠癌的多模态分子影像探针77-107
引言77-81
结果与讨论81-101

4.1 多模态探针的构建对策81-82

4.2 生物正交反运用于连接的动力学比较82-86

4.3 利用生物正交反应对磁纳米颗粒表面的修饰86-98

4.4 利用光点击反应构筑核素探针的化学策略探讨98-101

小结101
实验部分101-104
参考文献104-107
全文总结107-109
博士期间已发表及待发表论文109-110
致谢110-112