谈核酸基于核酸探针构型转换生物传感放大技术

论文导读：，双功能探针与目标物形成一个三叉复合物，解开其中一个茎干的自-互补部分，释放出与引物互补的片段，引发等温聚合取代反应。产生大量的聚合产物，通过双链插入剂SYBRGreenI插入双链DNAs，当有单色光源的激发时，能发出放大的荧光，达到信号放大的目的。实验结果证明基于等温聚合取代反应的双功能探针检测系统的有效性，且不需要化
摘要：核酸适体是以人工构建的随机寡核酸文库里筛选出来与配体高效、专一结合的DNA或RN段，这种筛选技术称为“指数富集的配系统统进化”(SELEX)。适体能与靶物质进行高度特异性的结合。核酸适体的成功问世，纠正了很久以来关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的看法。核酸适体能特异性地结合蛋白质、多肽、有机物、金属离子等多种靶物质。相对于抗体，适体还有特异性高、亲和力好、制备运输简便、目标广泛等优点。正因为适体这些独特的优点，适体作为特异性的分子识别元件被广泛运用于生物传感系统中。核酸适体生物传感器(aptamer sensor)是一种能够连续和可逆地进行分子识别的装置。基本原理为待测物质通过具有分子识别功能的接受器时，固定在接受器上的亲合配基与待测生物分子相互作用的瞬间发生能量转移，经过换能器，以电或光等方式输出，经过电子系统的放大处理和显示，可以对待测物质进行定性定量检测。这些传感系统灵敏、快速、选择性好，但是单纯利用适配体结合靶分子前后引起信号转变的检测策略，在提升灵敏度方面十分有限。为了实现对低浓度的目标物进行高灵敏度检测，我们对传感系统进行了信号放大处理，本论文前两部分内容就是对适体检测系统信号放大策略展开探讨，后一部分探讨核酸探针HCR放大技术。第二章设计了一种基于KF聚合酶反应的电化学适配体传感器，联合二茂铁功能化寡聚核苷酸，成功地检测了可卡因小分子。可卡因有着时，识别探针转变它的发卡构象，形成三叉复合物。适配体-可卡因复合物3‘端单链部分与捕获探针互补杂交。在聚合酶作用下，以识别探针为模板，以捕获探针为引物进行聚合延长反应。二茂铁标记的dUTP聚合在新合成的互补探针中，达到信号放大的目的。第三章设计了一种无标记，自锁式双功能寡聚核苷酸探针，用于不同的疾病标记物的平行检测。两种基于等温循环链置换聚合反应(CNDP)和循环非核酸目标置换聚合反应(CCDP)的信号放大技术分别用于检测p53基因和PDGF-BB。在目标物有着的情况下，双功能探针与目标物形成一个三叉复合物，解开其中一个茎干的自-互补部分，释放出与引物互补的片段，引发等温聚合取代反应。产生大量的聚合产物，通过双链插入剂SYBR Green I插入双链DNAs，当有单色光源的激发时，能发出放大的荧光，达到信号放大的目的。实验结果证明基于等温聚合取代反应的双功能探针检测系统的有效性，且不需要化学标记，具有设计弹性大、便捷性、简单性和成本低的特点。第四章提出了一种基于HCR放大反应检测DNA单碱基突变的电化学传感器。实验中设计的目标链不仅与捕获探针杂交，而且它的延长部分与引发链互补，引发链能引发HCR放大反应的发生，放大产物上的生物素与标记碱性磷酸酶的链霉亲和素反应，通过测量1-萘基磷酸盐底物酶催化反应后的电化学信号变化，实现对目标DNA的定量检测。实验结果表明该传感器对p53突变基因的检测具有高度的灵敏性，并能够在实际样本中特异性区分错配序列。关键词：核酸适配体论文链置换放大检测论文聚合酶延伸论文核酸适配体生物传感器论文荧光光谱浅析论文HCR放大检测论文电化学传感器论文基因突变点浅析论文
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Abstract7-12
第1章 绪论12-25

1.1 核酸适配体概述12-13

1.1 SELEX 技术的基本步骤与流程示意图12

1.2 核酸适配体的特点12-13

1.2 生物传感器概述13-16

1.2.1 生物传感器的概念、基本组成和工作原理13-14

1.2.2 生物传感器的分类14-15

1.2.3 生物传感器中适配体的固定化策略15-16

1.3 核酸适体在生化浅析中的运用近况16-20

1.3.1 核酸适配体在电化学浅析中的运用16-18

1.3.2 核酸适配体在荧光化学浅析中的运用18-20

1.4 放大策略20-23

1.4.1 热扩增反应包括聚合酶链式反应和连接酶链式反应21

1.4.2 等温扩增反应21-23

1.5 本论文探讨构想23-25

第2章 基于探针聚合延伸反应的可卡因电化学适配体传感器25-35

2.1 前言25-26

2.2 实验部分26-论文导读：生物样本中的PDGF-BB463.4小结46-48第4章基于HCR核酸电化学传感器及P53突变基因的放大检测48-584.1前言48-494.2实验部分49-514.2.1试剂与仪器49-504.2.2HCR反应系统的制备504.2.3金电极的处理和捕获探针的固定504.2.4实验步骤50-514.2.5细胞中基因DNA的提取及PCR扩增514.3结果与讨论51-574.3.1电化学
27

2.1 试剂与仪器26

2.2 核苷酸链标记二茂铁26-27

2.3 电极处理和二茂铁-dUTP 的固定27

2.4 凝胶电泳27

2.3 结果与讨论27-34

2.3.1 基于等温聚合酶反应的电化学适配体传感器原理27-28

2.3.2 适配体传感器的表征28-29

2.3.3 电泳实验结果29-30

2.3.4 优化长链探针30-31

2.3.5 优化聚合酶反应时间31

2.3.6 适配体传感器的浅析性能31-33

2.3.7 适配体传感器的选择性33-34

2.3.8 对于 1%人体尿样本中可卡因的检测浅析34

2.4 小结34-35

第3章 基于无标记双功能核苷酸光学探针的疾病标志物均相放大检测35-48

3.1 前言35-36

3.2 实验部分36-37

3.

2.1 试剂与探针36-37

3.

2.2 仪器37

3.

2.3 基于循环引发-置换聚合反应的扩增目标检测37

3.

2.4 凝胶电泳37

3.3 结果与讨论37-46

3.1 双功能核苷酸探针的设计及 CCDP 扩增原理37-39

3.2 双功能核苷酸探针的 CNDP/CCDP 信号扩增效率39-41

3.3 双功能探针利用 CCDP 放大策略对目标蛋白的浅析性能41

3.4 利用双功能核苷酸探针定量检测 p53 目标 DNA41-42

3.5 电泳实验结果42-44

3.6 引物序列的优化44-45

3.7 CCDP 调节的 PDGF 检测的特异性45-46

3.8 定量检测实际生物样本中的 PDGF-BB46

3.4 小结46-48

第4章 基于 HCR 核酸电化学传感器及 P53 突变基因的放大检测48-58

4.1 前言48-49

4.2 实验部分49-51

4.

2.1 试剂与仪器49-50

4.

2.2 HCR 反应系统的制备50

4.

2.3 金电极的处理和捕获探针的固定50

4.

2.4 实验步骤50-51

4.

2.5 细胞中基因 DNA 的提取及 PCR 扩增51

4.3 结果与讨论51-57
4.

3.1 电化学 DNA 生物传感器的原理51

4.

3.2 传感器表征51-52

4.

3.3 优化引发链探针52-54

4.

3.4 目标物检测性能54-55

4.

3.5 传感器的选择性(理想样本和实际样本)55-57

4.4 小结57-58
结论58-59
参考文献59-71
附录 A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文71-72
致谢72