简论辅酶野油菜黄单胞菌8004异柠檬酸脱氢酶酶学性质和辅酶特异性改造大纲

论文导读：及突变体酶的表达及纯化52-532.5XcIDH的分子量测定532.6XcIDH的酶学性质53-573讨论57-61参考文献61-65致谢65-66附：本人在读研期间合作发表的科研论文、获奖及参与课题基金情况66-67
摘要：异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)是三羧酸循环中的关键酶之一，以NAD~+或NADP~+为辅酶催化异柠檬酸氧化脱羧，生成-酮戊二酸，CO2和NAD(P)H，为生物体内的新陈代谢提供能量及为氨基酸合成提供前体物质。根据辅酶特异性，自然界中的IDH可以分为两类，NAD-依赖性IDH (EC1.1.1.41, NAD-IDH)和NADP-依赖性IDH (EC1.1.1.42, NADP-IDH)。NADP-IDH可以分为同源二聚体型和单体型两种形式。真核生物和大部分原核生物含有同源二聚体NADP-IDH，少数细菌含有单体NADP-IDH。NAD-IDH有同源二聚体和异源多聚体两种有着形式。真核生物的NAD-IDH为异源多聚体，一些细菌和古菌的NAD-IDH则为同源二聚体。本实验克隆了野油菜黄单胞菌8004(Xanthomonas campestris. campestris8004)的IDH基因(XcIDH)并在大肠杆菌中进行了表达。SDS-PAGE检测表明，XcIDH亚基分子量约为35kDa，凝胶过滤层析显示XcIDH的分子量约为61.9kDa，表明XcIDH在溶液中是一种同源二聚体结构。XcIDH的活性完全依赖于Mg~(2+)或Mn~(2+)，但受到Zn~(2+)和Ca~(2+)的强烈抑制。XcIDH在Mg~(2+)或Mn~(2+)有着条件下的最适pH分别为pH7.5和pH8.5，最适温度分别为40°C和45°C。热失活探讨发现XcIDH在45°C的条件下孵育20min，还残留50%的活性。酶动力学探讨表明，在Mn~(2+)有着条件下，XcIDH对NAD~+的K_m值为133μM，对NADP~+的K_m值为3260μM。 XcIDH对辅酶NAD~+的偏好性([k_(_(cat))/KDm]~(NA/[k_(cat)/K_m]~(NADP))是其对辅酶NADP~+偏好性的70倍。为了进一步探讨IDH辅酶特异性的分子机制，本探讨对XcIDH的辅酶特异性进行了转换。氨基酸序列比对发现，Asp268、Ile269以及Ala275是XcIDH结合辅酶NAD~+的关键位点。利用定点突变技术分别将这三个位点替换成Lys268、Tyr269以及Val275。突变体酶对NADP~+的偏好性([k_(cat)/K_m]~(NADP)/[k_(cat)/KDm]~(NA))是NAD~+的17倍，证明突变体酶的辅酶特异性成功的由NAD~+转换成NADP~+。对IDH的探讨主要集中于NADP-IDH的酶学性质及晶体结构，关于NAD-IDH酶学性质及进化联系探讨较少。本探讨首次以实验证明了XcIDH为二价金属离子依赖性的二聚体NAD-IDH且具有较好的热稳定性，为探讨野油菜黄单胞菌次级代谢产物的代谢调控探讨提供有用的信息。关键词：野油菜黄单胞菌论文异柠檬酸脱氢酶论文酶学性质论文辅酶特异性论文
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Abstract6-9
第一章 综述9-31
1 异柠檬酸脱氢酶9-21

1.1 β-脱羧脱氢酶超家族9-10

1.2 异柠檬酸脱氢酶的分类10-12

1.3 IDH 的空间结构12-17

1.4 IDH 的酶学性质17-19

1.5 IDH 的生物学功能19-20

1.6 IDH 的辅酶特异性改造20-21

2 野油菜黄单胞菌21-24

2.1 野油菜黄单胞菌介绍21-22

2.2 野油菜黄单胞菌探讨进展22-24

3 探讨作用和展望24
参考文献24-31
第二章 野油菜黄单胞菌 8004 异柠檬酸脱氢酶生化特性及辅酶特异性探讨31-65
1 实验材料与策略32-47

1.1 实验材料32-35

1.2 实验策略35-47

2. 实验结果47-57

2.1 XcIDH 基因的克隆与鉴定47-48

2.2 突变体重组质粒的获得48-49

2.3 XcIDH 序列同源性浅析49-52

2.4 XcIDH 及突变体酶的表达及纯化52-53

2.5 XcIDH 的分子量测定53

2.6 XcIDH 的酶学性质53-57

3 讨论57-61
参考文献61-65
致谢65-66
附：本人在读研期间合作发表的科研论文、获奖及参与课题基金情况66-67