谈谈鼻咽癌LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信号通路激活抵抗促炎因子IL-6推动鼻咽癌发生进展学生

论文导读：七大生物学特点,慢性炎症在触发肿瘤发生、推动肿瘤进展中起着非常重要的作用；炎症诱导的肿瘤称为炎症相关性肿瘤。鼻咽癌是一种具有显著地区差别的恶性肿瘤。鼻咽由于生理和解剖位置的特性,鼻咽上皮细胞时刻受到各种外源病原微生物如EBV和有毒化学物质等损害,使得鼻咽粘膜保护机制容易被破坏,极易导致鼻咽慢性炎症,因而有利于
摘要：[探讨背景]慢性炎症是肿瘤的第七大生物学特点,慢性炎症在触发肿瘤发生、推动肿瘤进展中起着非常重要的作用；炎症诱导的肿瘤称为炎症相关性肿瘤。鼻咽癌是一种具有显著地区差别的恶性肿瘤。鼻咽由于生理和解剖位置的特性,鼻咽上皮细胞时刻受到各种外源病原微生物如EBV和有毒化学物质等损害,使得鼻咽粘膜保护机制容易被破坏,极易导致鼻咽慢性炎症,因而有利于诱导鼻咽癌发生进展,由此鼻咽癌也是一种炎症相关性肿瘤。然而,鼻咽慢性炎症如何诱发鼻咽癌发生进展,尤其是在此历程中激活的免疫细胞如巨噬细胞、鼻咽上皮细胞充当何种角色,目前不是很清楚。LPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌表达下调的基因。现有探讨表明LPLUNC1基因编码的蛋白是一种分泌性蛋白,大量有着于鼻咽和呼吸道分泌物、灌洗液和痰液中；LPLUNC1蛋白可借助其BPI结构域行使宿主防御功能,具有杀菌抗炎的作用,而BPI结构域可以抑制肿瘤生长与转移。由此,我们对LPLUNC1基因在鼻咽慢性炎症推动鼻咽癌发生进展历程中的作用及其相关分子机制进行了探讨。[炎症因子刺激鼻咽癌上皮细胞参与炎症反应]为尽可能的获取炎症时各种促炎因子,我们用低浓度LPS(10ng/ml,近似于细菌脂多糖的生理浓度,如细菌感染时)刺激巨噬细胞,qRT-PCR检测发现低浓度LPS可显著上调促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8基因表达,ELISA检测显示在巨噬细胞上清培养液中含有大量的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8。由此,为能更好的在体外模拟炎症环境,反映慢性炎症时鼻咽癌细胞的状态,我们收集低浓度LPS刺激和未刺激巨噬细胞培养上清作为条件培养基(分别以D-THP-LPS, D-THP表示)处理鼻咽癌5-8F细胞,检测促炎因子对5-8F细胞的影响。结果显示,无论在mRNA水平还是蛋白水平,鼻咽癌5-8F细胞经D-THP-LPS条件培养基处理24小时后,细胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8表达显著增加,D-THP-LPS条件培养基可推动鼻咽癌5-8F细胞增殖,激活NF-κB和Stat3信号通路。说明炎症微环境下鼻咽癌上皮细胞可因炎性因子的刺激而激活NF-κB和Stat3信号通路,自分泌促炎因子,维持和扩大局部炎症反应,以而推动鼻咽癌发生进展。[IL-6推动鼻咽癌发生进展]促炎因子IL-6是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌的主要促炎因子之一,在炎症促肿瘤发生进展历程中具有很重要的作用,而目前IL-6和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对鼻咽癌发生进展的影响不是很清楚。由此我们检测浅析了鼻咽癌组织中IL-6蛋白表达情况和TAMs浸润程度,IL-6对鼻咽癌细胞生长的影响。采取鼻咽癌组织芯片,免疫组化检测发现鼻咽癌组织中IL-6和CD68(TAMs分子标记物,表达强弱可以反映TAMs在肿瘤组织中浸润程度)均呈强阳性表达,IL-6蛋白表达与TAMs浸润密度正相关,Kaplan-Meier存活浅析显示IL-6蛋白表达越高或者TAMs浸润密度越高,鼻咽癌患者预后越差；外源IL-6可推动鼻咽癌细胞增殖、加速细胞周期演进,同时免疫荧光、荧光素酶报告系统及Western blot检测显示IL-6可激活NF-κBp65和p-Stat3蛋白。由此说明鼻咽癌组织中TAMs浸润和IL-6蛋白表达与鼻咽癌发生进展密切相关,IL-6可通过激活NF-κB和Stat3蛋白推动鼻咽癌发生进展。[LPLUNC1基因抑制鼻咽癌细胞生长]前期探讨显示LPLUNC1基因在鼻咽癌组织中低表达,可能是鼻咽癌潜在的抑瘤基因。运用鼻咽癌组织芯片,免疫组织化学检测我们发现LPLUNC1蛋白在正常鼻咽上皮和腺体中高表达,而在大多数鼻咽癌组织中低表达或阴性表达,LPLUNC1蛋白表达下调与鼻咽癌临床进展分期正相关,Kaplan-Meier存活显示LPLUNC1蛋白阳性表达的鼻咽癌患者临床预后显著好于阴性表达患者,生长曲线绘制、MTT及裸鼠成瘤等实验均显示LPLUNC1基因可显著抑制鼻咽癌细胞生长与增殖；流式细胞和凋亡检测发现LPLUNC1基因可引起鼻咽癌细胞G0/G1期阻滞和诱导凋亡；进一步探讨显示,LPLUNC1基因可通过抑制鼻咽癌细胞NF-κB和Stat3信号传导通路,下调CDK4、cycpn D1、Bcl-2基因表达,上调p21、Bax基因表论文导读：调19个,下调25个。这些差别表达蛋白质按其功能分类主要是(1)分子伴侣蛋白；(2)细胞骨架蛋白；(3)参与细胞新陈代谢的酶类或蛋白；(4)信号转导分子；(5)其他蛋白。结果表明LPLUNC1基因可能通过调控上面陈述的蛋白分子表达参与细胞代谢、增殖、转录以及信号转导等生物学历程,以而影响鼻咽癌的生长。随后,我们对上调差别蛋白Prohibi
达。随后我们分别利用Jak2和NF-κB特异性抑制剂(AG490、BAY11-7082)分别阻断HNE2/Vector、 HNE2/LPLUNC1细胞中Stat3和NF-κB信号通路,结果发现AG490、BAY11-7082均能显著抑制鼻咽癌细胞增殖,而LPLUNC1基因与各抑制剂之间具有显著的协同作用。上面陈述的结果表明LPLUNC1基因可抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活,引起G0/G1期阻滞和诱导凋亡,以而抑制鼻咽癌细胞生长。[LPLUNC1抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活]我们探讨显示IL-6可通过激活NF-κB和Stat3推动鼻咽癌细胞生长；组织芯片免疫组化结果浅析发现鼻咽癌组织中LPLUNC1蛋白表达与IL-6蛋白表达和TAMs浸润密度显著负相关,同时运用激光捕获显微切割技术分离获得纯化鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织,qRT-PCR检测也证实鼻咽癌组织中LPLUNC1mRNA表达与IL-6mRNA表达显著负相关,提示LPLUNC1可能参与炎症反应,具有抑制IL-6分泌和TAMs浸润的作用。由此,我们探讨了LPLUNC1对IL-6推动鼻咽癌细胞增殖的影响。首先我们确证了LPLUNC1可显著抑制LPS诱导的鼻咽癌细胞和巨噬细胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1p和IL-8,参与抗炎反应；随后探讨发现,LPLUNC1基因可显著抑制IL-6对鼻咽癌细胞的促增殖和加速细胞周期演进的作用,荧光素酶报告基因检测发现尽管HNE2细胞受到IL-6的刺激,LPLUNC1基因仍可显著抑制NF-κB和Stat3的转录活性,免疫荧光检测显示LPLUNC1基因可显著抑制IL-6诱导的NF-κBp65和Stat3舌化入核,Western blot检测也显示LPLUNC1基因可显著抑制IL-6诱导的NF-κBp65和p-Stat3蛋白表达,NF-κBp65蛋白表达减少的同时伴有IKKP蛋白表达减少和IκBα蛋白表达增加,p-Stat3蛋白表达减少的同时伴有p-Jak2蛋白表达减少,LPLUNC1基因还可通过抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活,下调cycpn D1、Bcl-2基因表达,上调p21、Bax基因表达。由此,LPLUNC1基因可通过抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活,抵抗促炎因子IL-6对鼻咽癌细胞增殖的推动作用。[LPLUNC1对鼻咽癌5-8F细胞蛋白质表达谱的影响]蛋白质是生命活动中生物学功能的真正执行者、生命现象的直接体现者,探讨生命活动中尤其是病理历程中发生转变的蛋白质分子具有重大作用。由此,为进一步了解LPLUNC1在鼻咽癌发生进展中的作用,我们采取荧光差别凝胶电泳(2D-DIGE)和质谱浅析技术获得了鼻咽癌5-8F细胞过表达LPLUNC1基因前后的差别蛋白质变化。共鉴定出44个差别表达蛋白质,包括上调19个,下调25个。这些差别表达蛋白质按其功能分类主要是(1)分子伴侣蛋白；(2)细胞骨架蛋白；(3)参与细胞新陈代谢的酶类或蛋白；(4)信号转导分子；(5)其他蛋白。结果表明LPLUNC1基因可能通过调控上面陈述的蛋白分子表达参与细胞代谢、增殖、转录以及信号转导等生物学历程,以而影响鼻咽癌的生长。随后,我们对上调差别蛋白Prohibitin (PHB)、下调差别蛋白hypoxia up-regulated1precursor (HYOU1)和calreticupn precursor variant (CALR)进行了验证。结果显示,LPLUNC1基因转染5-8F细胞前后上面陈述的差别蛋白质表达确实有着差别,与质谱鉴定结果一致；对Prohibitin蛋白进一步探讨发现,Prohibitin蛋白在正常鼻咽组织中呈高表达,而在绝大部分鼻咽癌组织中呈低表达,Prohibitin蛋白表达降低与鼻咽癌的临床进展分期和转移相关,Kaplan-Meier存活浅析和多因素浅析发现Prohibitin蛋白阴性表达与鼻咽癌患者预后差密切相关。提示Prohibitin可能是鼻咽癌的重要分子标志。关键词：鼻咽癌论文LPLUNC1论文炎症论文NF-κB论文Stat3论文
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服人员哦。摘要5-9
ABSTRACT9-13
目录13-15
主要縮略词简表15-16
第一章 前言16-21
技术路线20-21
第二章 材料与策略21-45
1 材料21-28
2 策略28-45
第三章 结果45-91
第一部分 促炎因子诱导鼻咽癌上皮细胞参与炎症反应,推动鼻咽癌细胞生长45-55

1.1 鼻咽癌组织中IL-6蛋白表达和TAMs浸润程度及临床作用45-47

1.2 促炎因子刺激鼻咽癌上皮细胞自分泌炎性因子,参与炎症反应47-51

1.2.1 低浓度LPS诱导巨噬细胞分泌促炎因子47-48

1.2.2 条件培养基可诱导鼻咽癌细胞分泌促炎因子、推动鼻咽癌细胞增殖48-50

1.2.3 条件培养基可激活NF-κB和Stat3信号通路诱导鼻咽癌细胞分泌促炎因子、推动鼻咽癌细胞增殖50-51
1.3 IL-6可激活NF-κB和Stat3表达推动鼻咽癌细胞的生长与增殖51-54

1.3.1 IL-6推动鼻咽癌细胞的生长与增殖51-52

1.3.2 IL-6可激活NF-κB和Stat3表达52-54

小结54-55
第二部分 LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活抵抗促炎因子IL-6诱导的鼻咽癌发生进展55-81

2.1 LPLUNC1抑制鼻咽癌的发生进展55-72

2.

1.1 鼻咽癌组织中LPLUNC1蛋白表达及临床作用55-56

2.

1.2 LPLUNC1抑制鼻咽癌细胞的生长56-59

2.

1.3 LPLUNC1对鼻咽癌细胞周期的影响59-60

2.

1.4 LPLUNC1对鼻咽癌细胞凋亡的影响60-61

2.

1.5 LPLUNC1对鼻咽癌细胞裸鼠成瘤的影响61-63

2.1.6 LPLUNC1抑制鼻咽癌组织和细胞中NF-κB和Stat3信号通路的激活63-71
2.

1.7 LPLUNC1对细胞周期、凋亡调控分子表达的影响71-72

2.2 LPLUNC1通过抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路激活抵抗IL-6推动的鼻咽癌发生进展72-80

2.1 LPLUNC1抑制LPS诱导的鼻咽癌细胞和巨噬细胞分泌促炎因子73-75

2.2.2 LPLUNC1抑制IL-6对鼻咽癌细胞的促增殖和加速细胞周期演进的作用75-77
2.2.3 LPLUNC1在鼻咽癌细胞中抑制IL-6对NF-KB和Stat3信号通路的激活77-80
小结80-81
第三部分 LPLUNC1对鼻咽癌5-8F细胞蛋白质表达谱的影响81-91

3.1 LPLUNC1转染5-8F细胞的差别蛋白质表达谱浅析81

3.2 差别表达蛋白质点的质谱鉴定81-85

3.3 差别表达蛋白质功能分类85-86

3.4 差别表达蛋白质的验证86-90

3.4.1 差别表达蛋白质基因水平或蛋白水平验证86-88

3.4.2 免疫组织化学检测Prohibitin在鼻咽癌组织中表达变化及浅析其临床作用88-90
小结90-91
第四章 讨论91-103

4.1 促炎因子诱导鼻咽癌上皮细胞参与炎症反应91-92

4.2 IL-6通过激活NF-κB和Stat3信号通路推动鼻咽癌细胞生长92-94

4.3 LPLUNC1抑制鼻咽癌的发生进展94-96

4.4 LPLUNC1抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活96-99

4.5 鼻咽癌5-8F细胞过表达LPLUNC1前后差别蛋白质表达谱浅析99-102

4.6 Prohibitin基因低表达可能是鼻咽癌恶性进展和不良预后的重要分子标志102-103
第五章 结论103-104
参考文献104-116
综述116-132
参考文献123-132
致谢132-133
攻读学位期间主要成果133-134