分析耐药泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61耐药与播散机制基因组学如何

论文导读：
摘要：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, Ab)是医院内感染中常见的一种病原菌,其耐药不足日趋严重,中国CHINET细菌耐药性监测报告,2010年鲍曼不动杆菌泛耐药株分离率高达21.4%,较2009年17.0%又有所增加,且均高于同年铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌科细菌的泛耐药株分离率。多重耐药和泛耐药的鲍曼不动杆菌,已成为临床亟待解决的棘手难题。近年来,随着高通量测序技术的快速进展,基因组学和比较基因组学的探讨策略为细菌学领域引入新的探讨平台。本实验采取微生物学、分子生物学和生物信息学浅析策略揭示泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61的多重耐药和耐药播散的机制,为指导临床合理利用抗菌药物,避开或减少细菌耐药性的出现,防控细菌耐药播散,研发新型抗菌药物和新作用靶位提供依据。探讨目的1、了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61的基因组基本特点,浅析其多重耐药表型与耐药基因型。2、了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中外排泵系统的分布,浅析外排泵(AdeABC、AdeIJK、AdeFGH、AbeM、AbeS、CraA、MdtL、AmvA及ABTJ_00034/35/36、ABTJ_00275/276/277等5个功能未知的外排泵)和外膜蛋白(OmpA、OmpW)的表达,探讨外排泵和外膜蛋白在菌株多重耐药中的作用。3、了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中可移动元件(整合子、转座子、插入序列、质粒)的分布,探讨耐药播散机制。探讨策略1、菌株收集与药敏试验：收集自2009年天津市某甲等医院临床分离的鲍曼不动杆菌W61,经常规、生化、API20NE纸条鉴定。采取微量肉汤稀释法和琼脂纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌W61对16种常用抗菌药物(哌拉西林他唑巴坦、头孢氨噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢哌酮／舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星、亚胺培南、美罗培南、多粘菌素)的MIC值(或抑菌圈直径),确定其耐药表型。2、全基因组高通量测序与序列浅析：运用Roche454FLX测序平台,对鲍曼不动杆菌临床株W61进行全基因组测序,利用相关软件和聚合酶链式反应(PCR)填补空缺片段,拼接完整的基因组序列,提交Genbank。运用BASys细菌注释系统进行基因组和质粒的基因注释,浅析菌株耐药表型与耐药基因型的联系。3、泵抑制剂干预试验与外排泵及外膜蛋白基因表达检测：采取微量肉汤稀释法测定未加用和加用泵抑制剂CCCP时鲍曼不动杆菌临床株W61对8种抗菌药物(左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、头孢他定、头孢哌酮/舒巴坦)的MIC值,了解泵抑制剂对菌株耐药表型的影响。运用TransDB数据库浅析多重耐药株W61基因组中外排泵系统的分布情况。选取鲍曼不动杆菌ATCC17978为对照株,以recA为内参基因,采取实时荧光定量RT-PCR策略对鲍曼不动杆菌W61和ATCC17978的13种外排泵基因(adeB、 adeJ、adeG、abeM、abeS、craA、mdtL、amvA及ABTJ_00035、ABTJ_00276等5个功能未知的泵基因)和2种外膜蛋白基因(ompA、ompW) mRNA的表达进行相对定量浅析。泛耐药株W61外排泵AdeABC的调控系统AdeRS、外排泵ABTJ_00034/35/36上游调控序列ABTJ_00033和外排泵AdeFGH的调控系统AdeL的结构基因,与GenBank公布的ATCC17978相应序列进行比对浅析。4、可移动元件分布：运用Genbank-nr和IS finder数据库,经序列比对浅析鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中可移动元件(整合子、转座子、插入序列、质粒)的分布及其携带的耐药基因,浅析可移动元件在菌株耐药性的水平播散中的作用。探讨结果1、药敏试验结果：鲍曼不动杆菌临床株W61对抗假单胞菌头孢菌素、碳青霉烯类抗菌药物、含舒巴坦的复合制剂、氟喹诺酮类抗菌药物和氨基糖苷类抗菌药物均耐药,对多粘菌素敏感,为泛耐药株。2、基因组序列浅析：泛耐药株W61基因组(Genbank登录号CP003500)全长3964912bp,平均GC含量为39.11%,包含3731个蛋白质编码基因,6个rRNA编码基因,74个tRNA编码基因；泛耐论文导读：
药株W61携带2个质粒,plaidA全长77528bp,平均GC含量34.05%,含有109个蛋白质编码基因,plaidB全长110967bp,平均GC含量41.61%,含有123个蛋白质编码基因。基因组携带：β-内酰胺类耐药基因ADC型ampC,氨基糖苷类耐药基因(盒)aacA4、aadA1、 aacC1、armA、strA、strB,氟喹诺酮类作用位点gyrA突变,碳氢霉烯类耐药基因oxa-23、oxa-66,磺胺类耐药基因sul1、sul2,氯霉素耐药基因盒catB8。3、泵抑制剂对耐药表型的影响及外排泵与外膜蛋白基因表达情况：泛耐药株W61在利用CCCP后对8种抗菌药物(左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、头孢他定、头孢哌酮／舒巴坦)的MIC值均较前下降4倍或4倍以上。泛耐药株W61基因组共包含RND家族外排泵8个,MFS家族外排泵6个,ABC家族外排泵1个,MATE家族外排泵2个,R家族外排泵3个。泛耐药株W61外排泵基因adeB、abeM、ABTJ_00035、ABTJ_00276和外膜蛋白基因ompA的mRNA相对表达水平高于对照株ATCC17978,其差别有统计学作用。调控基因adeRS、ABTJ_00033出现基因突变及缺失,而调控基因adeL序列无基因突变。外膜蛋白基因carO出现基因突变。4、可移动元件分布情况：泛耐药株W61基因组携带可移动原件：质粒2个、Ⅰ类整合子2个、插入序列片段9类(包括ISCRs2个)、转座酶基因23个、AbaR型耐药岛1个。其中质粒、Ⅰ类整合子和ⅠSCRs均携带耐药基因,并构成耐药基因簇-复合Ⅰ类整合子和AbaR型耐药岛。探讨结论1、泛耐药鲍曼不动杆菌W61基因组(Genbank登录号CP003500)全长3.96Mbp,包含2个质粒。基因组和质粒中携带β-内酰胺类耐药基因ampC、氨基糖苷类耐药基因(盒)aacA4、aadA1、aacC1、armA、strA、strB、碳氢霉烯类耐药基因oxa-23、oxa-66、磺胺类耐药基因sul1、sul2、氯霉素耐药基因盒catB8,有着氟喹诺酮类作用位点gyrA突变,与菌株泛耐药表型相一致。2、泵抑制剂CCCP的运用,可使泛耐药鲍曼不动杆菌W61对多种抗菌药物MIC值较前降低,这表明外排泵功能对菌株W61多重耐药有一定贡献。外排泵系统在泛耐药鲍曼不动杆菌W61的基因组中广泛分布,外排泵AdeABC、AbeM、 ABTJ_00034/35/36、ABTJ_00275/276/277的高表达可能与菌株W61的多重耐药有关,调控基因adeRS和ABTJ_00033基因突变和氨基酸替换可能与外排泵AdeABC和ABTJ_00034/35/36表达上调有关。3、可移动元件在泛耐药鲍曼不动杆菌W61的基因组中广泛分布,其中质粒、Ⅰ类整合子和ISCRs均携带耐药基因,并构成耐药基因簇-复合Ⅰ类整合子和AbaR型耐药岛,对泛耐药株W61多重耐药性的形成及水平传播可能有一定作用。关键词：鲍曼不动杆菌论文基因组学论文泛耐药论文耐药播散论文外排泵论文可移动元件论文
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Abstract7-12
缩略语/符号说明12-15
前言15-22
探讨近况、成果15-20
探讨目的、策略20-22

一、鲍曼不动杆菌临床株W61耐药表型与耐药基因型联系的基因组学探讨22-55

1.1 材料和策略22-35

1.1 材料22-25

1.2 策略25-35

1.2 结果35-49

1.3 讨论49-54

1.4 小结54-55

二、主动外排系统和外膜蛋白在鲍曼不动杆菌泛耐药株W61多重耐药中的作用55-79

2.1 材料和策略55-62

2.

1.1 材料55-56

2.

1.2 策略56-62

2.2 结果62-73

2.3 讨论73-78

2.4 小结78-79

三、泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61耐药播散机制的探讨79-89

3.1 材料和策略79-80

3.

1.1 材料79

3.

1.2 策略79-80

3.2 结果80-84

3.3 讨论84-88

3.4论文导读：小结88-89全文结论89-90论新点90-91参考文献91-97发表论文和参加科研情况说明97-98综述98-110综述参考文献106-110致谢110上一页123
小结88-89
全文结论89-90
论新点90-91
参考文献91-97
发表论文和参加科研情况说明97-98
综述98-110
综述参考文献106-110
致谢110