阐述核糖核酸核糖核酸酶抑制因子过表达对黑色素瘤细胞生长、凋亡、侵袭和转移影响及分子机制

论文导读：
摘要：目的构建携带有核糖核酸酶抑制因子（RI）基因的真核过表达载体，检测其在体内和体外对黑色素瘤细胞生长，凋亡，侵袭和转移的影响，并初步探讨其作用的分子机制。策略根据RI基因序列设计引物，RI基因经PCR扩增后连接到pIRES2-EGFP上，通过酶切和DNA测序鉴定载体，稳定转染B16和B16-F10细胞，并分别命名为B16-RI/B16-F10-RI, B16vector/B16-F10vector,通过RT-PCR、western blot和免疫荧光检测RI蛋白的过表达。MTT检测细胞的增殖；Tunel和Hochest33342检测各个样本细胞的凋亡；流式细胞术浅析每个样品细胞的周期及凋亡率；观察各组细胞形态及细胞内微丝骨架的变化；黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化；Western Blot检测ILK的表达，和p-Akt, p-GSK3β，β-catenin信号分子的表达和凋亡相关蛋白Caspase3, Bax及Bcl-2的表达水平；同时也检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及与EMT相关蛋白Snail, Slug, Vimentin, Twist, N-cadherin,E-cadherin的表达水平；RT-PCR、免疫荧光和western blot检测RI过表达后ANG的表达水平；并通过激光共聚焦显微镜观察RI与ANG的共定位。将B16/B16-F10，B16vector/B16-F10vector, B16-RI/B16-F10-RI组细胞分别注射到C57BL/6小鼠的左腋皮下和眼眶静脉，三星期后处死小鼠，皮射的老鼠取出瘤组织并称重，眼眶静脉注射的老鼠取出肺称重并对肺上转移灶进行计数。移植瘤组织切片HE染色和CD31抗体检测肿瘤微血管密度的变化；转移模型的肺组织切片HE染色观察肺上转移灶的变化；免疫组织化学和免疫组织荧光检测各组移植瘤组织中RI, ANG, ILK, MMP-2, nm23-H1, Snail, Slug, Vimentin, Twist,N-cadherin和E-cadherin蛋白表达的差别。结果经酶切和测序证实pIRES2-EGFP-RI真核表达载体构建成功，经G418筛选获得稳定表达细胞株后，RT-PCR,Western Blot及免疫细胞荧光检测实验组RI的mRNA和蛋白表达水平论文导读：密度显著减少，同时MMP2,Snail,Slug,Vimentin,Twist,N-cadherin,ILK,p-Akt,p-GSK3β,β-catenin在瘤组织中表达减少，RI，nm23-H1,E-cadherin表达升高。Tunel细胞凋亡检测结果表明，B16-RI/B16-F10-RI组中凋亡细胞较其他两组显著增加。结论成功构建针pIRES2-EGFP-RI真核表达载体，过表达RI通过调节与EMT相关蛋白Snail,Slu
大大升高，并检测到当RI过表达时ANG的mRNA和蛋白表达水平下降（P0.05），激光共聚焦显示RI与ANG在细胞内有着着共定位现象，MTT结果显示B16-RI/B16-F10-RI细胞较B16/B16-F10vector及B16/B16-F10细胞增殖能力显著降低；Hochest33342和Tunel细胞凋亡检测结果证实B16-RI/B16-F10-RI细胞较B16/B16-F10vector及B16/B16-F10细胞凋亡显著增加；流式测周期和凋亡的结果显示B16-RI/B16-F10-RI细胞的S期显著增加，其凋亡率显著升高，表明RI表达上调后细胞生长停滞于S期，细胞凋亡率显著增高；形态学实验显示细胞由间质型向上皮型转换，细胞骨架被打乱；黏附、划痕和Transwell小室实验显示B16-RI/B16-F10-RI组细胞黏附，迁移和侵袭能力下降；细胞免疫荧光结果显示，B16-RI/B16-F10-RI细胞中p-Akt和p-GSK3β的表达显著减少（P0.05），Western Blot显示，与对照组相比，B16-RI/B16-F10-RI细胞中MMP2, MMP9, Snail, Slug, Vimentin, Twist, N-cadherin, ILK,p-Akt, p-GSK3β, Bcl-2及β-catenin的表达显著减少（P0.05），E-cadherin,nm23-H1,活化的Caspase3和Bax蛋白的表达显著增加（P0.05）,移植瘤动物实验显示，与对照组相比，实验组小鼠的瘤重显著降低（P0.05），肺转移实验显示实验组小鼠肺上的转移灶显著减少，瘤组织中的血管密度显著减少，同时MMP2, Snail, Slug, Vimentin,Twist, N-cadherin, ILK, p-Akt, p-GSK3β, β-catenin在瘤组织中表达减少，RI，nm23-H1,E-cadherin表达升高。Tunel细胞凋亡检测结果表明，B16-RI/B16-F10-RI组中凋亡细胞较其他两组显著增加。结论成功构建针pIRES2-EGFP-RI真核表达载体，过表达RI通过调节与EMT相关蛋白Snail,Slug,Vimentin,Twist,N-cadherin等和转移相关蛋白MMP2, MMP9等抑制黑色素瘤细胞的侵袭和转移能力，并通过调控ANG,论文导读：
ILK,p-Akt, p-GSK-3β，β-catenin等蛋白的表达抑制黑色素瘤细胞的增殖并推动细胞的凋亡；动物实验证实上调RI后能够有效的抑制黑色素瘤细胞在体内的生长和转移的能力，其机制可能与RI上调后调节EMT相关蛋白和通过ILK/PI3K/T通路，调控凋亡相关蛋白的表达有关。关键词：核糖核酸酶抑制因子论文增殖论文凋亡论文侵袭论文转移论文
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摘要7-10
ABSTRACT10-13
前言13-15
第一部分 RI和ANG真核表达载体的构建及鉴定15-24

1.实验材料15-16

2 实验策略16-20
3 实验结果20-23
4 结论23-24
第二部分 PIRES2-EGFP-RI真核表达载体在黑色素瘤细胞中表达与鉴定24-31

1.实验材料24-25

2 实验策略25-28
3 实验结果28-29
4 结论29-31
第三部分 RI 过表达对黑色素瘤细胞增殖、凋亡和肿瘤生长影响及分子机制的探讨31-45
1 实验材料31-32
2 实验策略32-36

3.结果36-43

4.结论43-45

第四部分 RI 过表达对黑色素瘤细胞及肿瘤侵袭和转移的影响及分子机制探讨45-55
1 实验材料45-46
2 实验策略46-48
3 结果48-54

4.结论54-55

讨论55-58
参考文献58-60
文献综述60-67
参考文献65-67
致谢67-68
攻读硕士学位期间发表的学术论文68-69