谈谈基因复合探针实时荧光PCR检测细菌耐药基因（bla_(KPC)bla_(NDM-1)）策略建立与评价

论文导读：光信号的变化来检测细菌耐药基因(blaKPCblaNDM-1)。为提升灵敏度和扩增效率,获得最佳检测结果,试验了包括甲酰胺浓度、MgC12浓度、引物浓度、探针浓度、荧光探针与淬灭探针的比例、Taq酶的用量、退火温度、退火时间、核酸提取策略、样本类型、适用机型等因素对扩增的影响。并对试剂盒准确性、灵敏度、精密度等各项指标进行评
摘要：目的针对KPC和NDM-1介导的碳青霉烯类耐药,建立实时荧光PCR检测策略,并研制出检测试剂盒,用来快速、准确、灵敏的检测携带blaKPC基因、blaNDM-1基因的耐药菌株。策略基于复合探针技术原理,以blaKpC,blaNDM-1序列作为待检靶基因,分别找到它们的基因保守区来设计引物、探针,建立PCR体外扩增策略,通过荧光信号的变化来检测细菌耐药基因(blaKPC blaNDM-1)。为提升灵敏度和扩增效率,获得最佳检测结果,试验了包括甲酰胺浓度、MgC12浓度、引物浓度、探针浓度、荧光探针与淬灭探针的比例、Taq酶的用量、退火温度、退火时间、核酸提取策略、样本类型、适用机型等因素对扩增的影响。并对试剂盒准确性、灵敏度、精密度等各项指标进行评估。结果细菌耐药基因blaKpC实时荧光PCR检测策略适用于Roche Light Cycler2.0、Roche480、ABI7500、Bio-Rad CFX-96等荧光PCR仪器。在Roche Light Cycler2.0荧光PCR仪器(20μ1系统)上反应液各成份用量确定为：3%甲酰胺,3.5mmol/L Mg2+浓度,1.0mmol/L dNTPs混合溶液,0.5μmol/L KPC上下游引物,0.2μmol/L KPC荧光探针,0.4μmol/L KPC淬灭探针,0.15μmol/L内对照引物,0.06μmol/L内对照探针,1.5U/20μ1系统Hotmaster Taq酶,0.1U/20μ1系统UDG酶,内对照模板浓度为1.0×104cfu/ml。反应条件：50℃C2min；93℃2min；40个循环扩增(93℃5s,55℃20s,72℃5s)；37℃10s。其他适用机型均采取30μ1系统,各成分用量和比例与20μ1系统的一致,反应条件：50℃C2min；94℃2min；40个循环扩增(94℃20s,55℃30s,72℃C10s)；25℃10s。最佳样本提取策略为DNA提取液提取法。最佳样本用量为2μ1/20μ1系统或3μ1/30μ1系统。细菌耐药基因blaKPC核酸检测试剂盒性能评估实验结果表明,检测策略的准确性、精密度良好,具有较高的灵敏度,对临床样本的检测下限可达到5cfu。对291例临床样本进行检测,其检测结果和测序结果比较,阳性符合率和阴性符合率均为100%,同时质控品的检测结果符合设计要求,质控品和所有临床样本的内对照均有荧光信号检出。细菌耐药基因blaNDM-1实时荧光PCR检测策略及优化结果与细菌耐药基因blaKPc的基本一致。细菌耐药基因blaNDM-1核酸检测试剂盒性能评估实验结果表明,检测策略的的准确性、灵敏度、精密度良好,对临床样本的检测下限可达到50cfu。对361例临床样本进行检测,其检测结果和测序结果比较,阳性符合率和阴性符合率均为100%,同时质控品的检测结果符合设计要求。通过在实验室条件下的稳定性探讨,得出2个试剂盒在37℃条件下的稳定期为24小时,在4℃条件下的稳定期为70天,在-20℃C条件下的稳定期至少为12个月,最多冻融4次。结论所研制的细菌耐药基因(blaKPC blaNDM-1)核酸检测试剂盒的准确性、灵敏度、精密度等各项指标的验证结果均达到了设计要求,可快速有效检测携带blaKpC基因、blaNDM-1基因的耐药菌株,能够满足临床实际利用要求,具有较高的临床运用价值。适用于产KPC、产NDM-1细菌感染的定性检测,可为环境监测、卫生防疫及临床诊断工作提供一种有效的检测工具。关键词：实时荧光PCR论文复合探针论文碳青霉烯类耐药论文bla_(KPC)基因论文bla_(NDM-1)基因论文
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Abstract6-8
目录8-10
第1章 绪论10-18

1.1 探讨背景10-11

1.2 探讨进展11-16

1.2.1 KPC探讨进展11-14

1.2.2 NDM-1探讨进展14-16

1.3 主要探讨内容16-18

第2章 实时荧光PCR检测细菌耐药基因bla_(KPC)技术探讨18-54

2.1 材料18-19

2.

1.1 参论文导读：

考品的来源18 2.

1.2 临床样本来源18-19

2.

1.3 主要试剂19

2.

1.4 主要仪器19

2.2 策略19-23

2.1 临床样本的处理19-20

2.2 样品处理液的配制20

2.3 两种核酸提取的策略20

2.4 基因工程菌的构建20-21

2.5 细菌的定量21

2.6 含dUTP模板的制备21

2.7 质控品的制备21

2.8 引物和探针的设计21-22

2.9 实时荧光PCR检测22-23

2.3 结果23-52

2.3.1 引物和探针的筛选23-25

2.3.2 样本的制备25-27

2.3.3 核酸提取策略和临床样本类型的确定27-30

2.3.4 PCR反应系统和反应条件的建立和优化30-41

2.3.5 适用机型41-42

2.3.6 试剂盒性能评估42-46

2.3.7 试剂盒稳定性探讨46-49

2.3.8 临床样本的PCR检测49-52

2.4 本章小结52-54

第3章 实时荧光PCR检测细菌耐药基因bla_(NDM-1)技术探讨54-78

3.1 材料54

3.

1.1 参考品的来源54

3.

1.2 临床样本来源54

3.

1.3 主要试剂54

3.

1.4 主要仪器54

3.2 策略54-56
3.

2.1 临床样本的处理54

3.

2.2 样品处理液的配制54

3.

2.3 两种核酸提取的策略54-55

3.

2.4 基因工程菌的构建55

3.

2.5 细菌的定量55

3.

2.6 含dUTP模板的制备55

3.

2.7 质控品的制备55

3.

2.8 引物和探针的设计55

3.

2.9 实时荧光PCR检测55-56

3.3 结果56-77

3.1 NDM-1引物和探针的筛选56-57

3.2 样本的制备57

3.3 核酸提取策略的确定57-59

3.4 PCR反应系统和反应条件的建立和优化59-67

3.5 适用机型检测结果比较67-68

3.6 临床样本的PCR检测68-70

3.7 试剂盒性能评估70-74

3.8 试剂盒稳定性探讨74-77

3.4 本章小结77-78

结论78-80
参考文献80-84
附录84-96
攻读学位期间发表的学术论文96-98
致谢98-99